碱性磷酸酶对大鼠自体原位肝移植后急性肺损伤的保护作用★

周陈杰，周杰

课题背景:目前肝移植处于较成熟的阶段，手术存活率极高，但是移植后的相关并发症严重影响预后，肺部损伤（肺部感染、肺功能衰竭）就是其中之一。

应用要点:文章在借鉴大鼠自体肝移植模型的基础上，进一步提出检测移植后大鼠肺部相关指标，以证实肺损伤的存在，并初步阐述肺损伤的产生机制。文章结果证实，肝脏移植术后肺部确实存在急性损伤，碱性磷酸酶对其具有保护作用。

同行评价:文章通过建立大鼠自体原位肝移植模型，观察肝移植术后肺部急性损伤情况及碱性磷酸酶对其的干预作用。结果证实碱性磷酸酶对肝移植术后肺部急性损伤具有保护作用。文章立题科学，设计合理，有一定学术意义。

周陈杰★，男，1981年生，江苏省启东市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事肝胆方面的研究。
santcruss@sohu.
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通讯作者:周杰，硕士，主任医师，南方医科大学南方医院肝胆外科，广东省广州市 510515 jacky@fimmu.
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摘要
目的: 肝移植术后并发症不仅包括肝脏本身的损害，亦能导致肝外多个器官功能衰竭，其中肺脏是较易且较早受累的器官。文章通过建立大鼠自体原位肝移植模型，观察肝移植术后肺部急性损伤情况及碱性磷酸酶的干预作用。
方法:①实验于2007-05/10在南方医科大学附属南方医院实验动物中心、消化内科实验室完成，动物实验方法符合动物伦理学要求。②选用SD大鼠24只，按随机数字表法分为对照组、自体原位肝移植组和碱性磷酸酶组，每组8只。后两组建立大鼠自体原位肝移植模型，对照组开腹后游离肝叶后即关腹，碱性磷酸酶组于肝脏恢复血供前5 min自舌静脉注入碱性磷酸酶。③手术结束后2 h检测肺组织髓过氧化物酶活性、丙二醛含量、肺组织表面活性蛋白A含量及肺组织干湿重比值，并行肝脏、肺脏病理检查。
结果:大鼠24只全部进入结果分析。①自体原位肝移植组、碱性磷酸酶组肺组织中髓过氧化物酶活性、丙二醛含量均高于对照组（P﹤0.01），碱性磷酸酶组肺组织中髓过氧化物酶活性、丙二醛含量均低于自体原位肝移植组（P﹤0.01）。②碱性磷酸酶组、自体原位肝移植组肺组织表面活性蛋白A含量较对照组低，而碱性磷酸酶组较自体原位肝移植组有所升高。③自体原位肝移植组、碱性磷酸酶组肺组织干湿重比值均低于对照组（P﹤0.01），碱性磷酸酶组肺组织干湿重比值高于自体原位肝移植组（P﹤0.05）。④病理结果显示，肝移植后大鼠肝、肺组织受到明显损害，而碱性磷酸酶能减轻损伤程度。
结论:肝移植术后肺部确实存在急性损伤，而碱性磷酸酶对其具有保护作用。
关键词:肝移植；肺/损伤；碱性磷酸酶；疾病模型，动物

周陈杰，周杰．碱性磷酸酶对大鼠自体原位肝移植后急性肺损伤的保护作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(5):805-808 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-805(ps).pdf]

中图分类号:R657.3
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)05-00805-04

Protective effect of alkaline phosphatase on acute lung injury after orthotopic autologous liver transplantation in rats

AIM:The complications following liver transplantation consist of the liver damage and the function failure of other organs, among which lung is the most prone and the earliest affected lesion. By establishing an autologous orthotopic liver transplantation (OLT) model in rats, this study was to investigate the acute lung injury after liver transplantation and the role of alkaline phosphatase (AP) in protection of the injury.
METHODS: ①The experiments were performed in the Test Animal Center and Digestion Laboratory, Nanfang Hospital, Southern Medical University from May to October in 2007. All the proposals were in accordance with the ethical standard of animals.②Twenty-four SD rats were randomly divided into three groups: sham-operation control group, autologous OLT group and AP group, each containing 8 animals. Autologous OLT models were induced in OLT group and AP group, while control group, the abdomen was only opened and then closed besides the liver lobes were isolated. Lingual vein injection of AP was given in AP group 5 minutes before the blood supply of the liver restored.③The concentration of myeloperoxidase (MPO), malondialdehyde (MDA) and surfactant protein A (SP-A) in lung tissue were respectively examined in each group, lung dry-to-wet weight ratio was also measured. Furthermore, hepatic and lung pathological sections were observed.
RESULTS: All the 24 rats were involved in the result analysis.①Compared to control group, the concentration of MPO and MDA in lung tissue were significantly increased in OLT group and AP group (P < 0.01), but they were lower in the group that pretreated with AP than in the group with autologous OLT group (P < 0.01).②The concentration of SP-A in lung tissue and lung dry-to-wet weight ratios were markedly decreased in the control group (P < 0.01), while they were significantly increased in the group pretreated with AP compared with the OLT group (P < 0.05).③Pathological examination showed that liver and lung damage were less severe in the group pretreated with AP after the liver transplantation.
CONCLUSION: Acute lung injury happens after liver transplantation, and AP plays a protective role in the injury.

Zhou CJ, Zhou J. Protective effect of alkaline phosphatase on acute lung injury after orthotopic autologous liver transplantation in rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(5):805-808(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-805(ps).pdf]

急性肺损伤多继发于休克、创伤、严重感染、大量失血等打击之后[1]，如不能及时诊断、行有效治疗，很可能发展为急性呼吸窘迫综合征，甚至死亡。而肝移植是个创伤性大、失血量多的手术过程，术后容易发生急性肺损伤，如不及时给予保护性处理，很可能对患者预后造成不良影响。据本院近年来肝移植的经验，移植后出现的肺部损伤在移植后严重并发症中占据一定的比例。目前有关肝移植术后急性肺损伤的发生机制正越来越多的为人们所重视。以往已经有一些学者对肝移植术后急性肺损伤作了相关研究，但是，目前肝移植术后急性肺损伤的机制仍不明确。本实验拟通过建立大鼠自体原位肝移植模型，观察肝移植术后肺部急性损伤情况以及碱性磷酸酶的干预作用。

设计:随机对照动物实验。
单位:南方医科大学南方医院肝胆外科。
材料:实验于2007-05/10在南方医科大学附属南方医院实验动物中心、消化内科实验室（国家重点科室）完成。选用健康、成年、SPF级纯系SD大鼠24只，雌雄不限，体质量250~280 g，购于南方医科大学实验动物中心（SCXK（粤）2006-0015，2006B023，2006A051）。动物实验方法符合动物伦理学要求。
设计、实施、评估者:设计、实施、评估均为本文作者，均经过正规培训。
方法:
动物模型制备与分组:将24只大鼠按随机数字表法分为对照组、自体原位肝移植组和碱性磷酸酶组，每组8只。术前禁食12 h，不禁水。采用腹腔注射3 g/L戊巴比妥30 mg/kg麻醉，按照文献[2]方法建立自体原位肝脏移植模型，使用门静脉、腹主动脉双重恒压灌注，除血管吻合外，其余方法同大鼠原位肝移植。对照组开腹后游离肝叶后即关腹;后两组行自体原位肝移植，碱性磷酸酶组于肝脏恢复血供前5 min自大鼠舌静脉注入碱性磷酸酶。
检测指标与方法[3]:无肝期结束后2 h，对照组则为关腹后2 h，切取右半肝部分肝组织行病理分析。然后打开胸腔，取右上肺称湿重后在80 ℃恒温箱内烘烤48 h至肺干重恒定，测取肺组织干湿重比值;右肺下叶用以测定肺组织丙二醛含量、髓过氧化物酶活性及肺组织表面活性蛋白A含量;右肺中叶用作病理分析。丙二醛、髓过氧化物酶均按照各自试剂盒进行测试。用Western-Blotting检测肺组织表面活性蛋白A含量，通过内参蛋白GAPDH对其进行半定量分析，再行灰度扫描。
主要观察指标:①各组大鼠肺组织干湿重比值、肺组织丙二醛含量、髓过氧化物酶活性及肺组织表面活性蛋白A含量。②各组大鼠肺、肝组织学变化。
统计学分析:由第一作者使用SPSS 11.5软件包进行数据处理，所有实验数据均以_x±s表示，使用单因素方差分析，P < 0.05为差异具有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析实验动物数量共为44只，其中纳入正式实验24只，另20只为预实验建立模型所用，纳入正式实验的24只大鼠全部进入结果分析。
2.2 各组大鼠肺组织干湿重比值变化自体原位肝移植组、碱性磷酸酶组肺组织干湿重比值均低于对照组（0.20±0.02，0.24±0.02，0.36±0.06，P < 0.01），碱性磷酸酶组肺组织干湿重比值高于自体原位肝移植组（P < 0.05）。
2.3 各组大鼠肺组织髓过氧化物酶活性及丙二醛含量变化见表1。

如表1所示，自体原位肝移植组、碱性磷酸酶组肺组织中髓过氧化物酶活性、丙二醛含量均高于对照组（P < 0.01），碱性磷酸酶组肺组织中髓过氧化物酶活性、丙二醛含量均低于自体原位肝移植组（P < 0.01）。
2.4 肺组织、肝组织组织学切片对比变化对照组肝脏组织形态结构基本正常（见图1）;自体原位肝移植组肝小叶结构不清，大部分肝细胞脂肪变性，细胞间及汇管区炎细胞浸润（见图2）;碱性磷酸酶组肝脏肝小叶周边部分肝细胞脂肪变性，中央静脉扩张（见图3）。对照组肺组织肺泡结构基本正常（见图4）;自体原位肝移植组肺泡间质重度增生，肺泡结构消失，呈实性改变，大量炎细胞浸润，血管壁增生玻璃样变（见图5）;碱性磷酸酶组肺泡间质轻中度增生，毛细血管充血、炎细胞浸润较明显，肺泡腔变窄（见图6）。提示碱性磷酸酶对移植后肝脏、肺脏有一定保护作用。

2.5 肺组织中肺组织表面活性蛋白A含量变化碱性磷酸酶组、自体原位肝移植组肺组织表面活性蛋白A含量低于对照组，而碱性磷酸酶组较自体原位肝移植组有所升高（见图7）。

肝脏移植经过全世界医学者半个世纪的努力，发展迅速，目前已成为肝脏外科较常见的手术治疗方式，为许多终末期患者带来了治愈的希望，但目前仍存有一些比较棘手的术后并发症，严重影响预后。这些并发症不仅包括肝脏本身的损害，亦能导致肝外多个器官功能衰竭，其中肺脏是较易且较早受累的器官[4]。结合一些学者的研究结果[5-15]，认为肝移植过程中的肝脏缺血再灌注是造成移植后肺损伤不容忽视的一个原因。肝脏缺血再灌注的过程中，机体微循环失调、免疫系统受损、细胞因子激活，一方面细胞因子的释放导致受其趋化的中性粒细胞活动能力增强，促进炎症反应，另一方面微循环失调、免疫系统受损可导致一些机体正常菌群的迁移，例如肠道细菌通过体循环到达肺血管床，其产生的脂多糖，亦能引起强烈的炎症反应。以上因素均能对肺脏造成严重损伤。作者在本实验中通过建立大鼠自体原位肝移植模型，以肺组织干湿重比值作为反映肺毛细血管通透性改变的重要指标;以肺组织中髓过氧化物酶活性、丙二醛含量变化来反映氧化反应程度的指标，其中髓过氧化物酶主要存在于中性粒细胞溶酶体内，是清除氧自由基所必需的酶，肺组织中髓过氧化物酶活性升高提示中性粒细胞在肺组织中聚集数目增加，肺组织中产生大量氧自由基，而丙二醛是具有毒性的脂质过氧化产物，故通过观察髓过氧化物酶活性、丙二醛含量变化可以了解肺组织中氧化反应的程度，并以此作为衡量肺组织受损伤程度的一类指标。有研究认为肺组织表面活性蛋白A含量降低与急性呼吸窘迫综合征严重程度呈负相关，即肺组织表面活性蛋白A含量下降可作为急性呼吸窘迫综合征发生的敏感标志，甚至可作为急性肺损伤高危患者的预警和预后指标，故可以通过观察肺组织中肺组织表面活性蛋白A含量的变化来了解肺部受损伤情况;另外，还通过观察病理切片观察肺组织受损伤情况。
从本实验结果中作者发现，相较于对照组，移植组肺组织髓过氧化物酶活性、丙二醛含量明显升高，肺组织干湿重比值、肺组织表面活性蛋白A含量明显降低，这说明移植组在手术后，肺组织中氧化反应增强，氧化和抗氧化系统的失衡造成了急性肺损伤，使机体内脂质过氧化产物增多，肺部具有保护作用的表面活性物质肺组织表面活性蛋白A含量减少，从而致使肺部毛细血管通透性增加，肺部水肿形成。而病理切片则进一步证明各组肺组织之间受损伤程度的差别。
以往的研究发现脂多糖抗体的使用能有效减少肝脏缺血再灌注后细胞因子的活化及肺部的损伤程度，说明肝脏缺血再灌注后迁移至肺部的菌群产生的脂多糖至少是肺部产生损伤的一个重要原因。而碱性磷酸酶经研究证实能通过脱磷作用使脂多糖失去活性。已有学者通过动物实验发现经静脉注入碱性磷酸酶，可有效减轻经历肝脏缺血再灌注过程的大鼠肝脏、肺脏的受损伤程度。这证实了碱性磷酸酶能通过脱磷作用灭活脂多糖，减轻局部炎症反应，发挥保护肝脏、肺脏的作用[16-20]。而本实验的结果显示，大鼠自体肝移植后，肺部确实存在损伤:髓过氧化物酶活性、丙二醛含量明显升高，肺组织干湿重比值明显减小，肺组织表面活性蛋白A含量明显减少。损伤跟异常的氧化反应有关。在通过静脉注入碱性磷酸酶后，能观察到肝脏移植术后肺脏局部的炎症反应明显减轻:过氧化产物的含量减少，肺脏表面活性保护物的丢失程度减轻，病理切片亦提示肺脏受损伤程度明显减轻。这些都说明了碱性磷酸酶在肝移植中发挥对肺脏的保护作用。
致谢:感谢南方医科大学南方医院肝胆外科张国伟、赵宏峰、邓润枢及南方医科大学生物技术工程学院王云丹等对本实验的大力支持。

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