犬活体肝移植模型的建立及评价*☆

张清军，潘明新，孔凡东，姚坤厚，高毅

课题背景：建立器官移植的大动物模型是开展器官移植工作的前提和进行基础研究工作的平台。犬活体肝移植接近于临床实际，能模拟临床活体肝移植的全部过程。

应用要点：由于犬对内脏瘀血的耐受能力较差，无肝期需采用体外静脉转流或门体静脉分流。文章在受体手术时，将受体肝脏分两步切除，消除了无肝期，避免了体外转流和分流的应用，并用套管法来重建胆道，简便了手术步骤, 明显缩短了手术时间, 基本消除了长时间麻醉、手术及体外静脉转流等非必需因素对受体全身生理指标的影响, 具有更高的稳定性和存活率。

同行评价：活体肝移植动物模型的建立是目前国内外比较棘手的问题，主要原因是动物对无肝期的耐受力差。文章通过保留部分肝组织，而不进行静脉转流或分流，待门静脉开放后再切除剩余肝组织，虽然在临床上无法实现，但在动物模型的建立方面有很大的优越性，值得借鉴。

张清军☆，男，1972年生，山东省费县人，汉族，南方医科大学在读博士，医师，主要从事肝移植基础与临床研究。
zhang72128@
163.com

通讯作者：高毅，博士，教授，博士生导师，南方医科大学珠江医院肝胆外科，广东省广州市 510282 gaoyi6146@163.
com

摘要
目的: 犬活体肝移植接近于临床实际，能模拟临床活体肝移植的全部过程。应用非体外转流和分流方法建立犬活体肝脏移植模型，以期为开展临床活体肝移植提供实验数据。
方法：①实验材料：实验于2006-05/2007-04在南方医科大学南方医院动物研究所完成，选用健康本地杂种犬36只，动物实验方法符合动物伦理学要求。②实验方法：将36只犬按随机数字表法分为供体组和受体组，共行非转流条件下犬活体肝脏移植手术18对次。活体供肝组行标准Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ叶左半肝切取术。受体组先行左侧Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ叶肝脏组织切除，在新肝植入后，再切除原肝残留Ⅵ，Ⅶ叶肝组织。③实验评估：检测动物手术时间、术中失血量、输血量及存活期；犬死后当天行尸体解剖明确死亡原因。
结果：成功建立非转流犬活体肝移植模型14只。①活体供肝组手术结果：供体术中死亡1只，术后第1天因出血死亡1只，术后5 d存活率为88.2%。手术时间（183.7±32.4）min，失血量为（78.5±12.8）mL，输血量0 mL，供肝的热缺血时间几乎为零，冷缺血时间（146.7±24.4）min。②受体组手术结果：术中死亡4只，其中创面出血2只，左肝静脉吻合口出血1只，1只死于急性肺水肿。术后存活14只，术后5 h存活率为85.7%；受体犬手术时间（276.7±34.1）min，无肝期0 min；失血量为（242.5±25.6）mL，输血量（230.6±47.3）mL。
结论：犬是理想的活体肝移植动物模型，受体肝脏分两步切除，新肝植入期，可有效维持受体血循环稳定，免除了体外转流或门腔分流的操作，为临床开展活体肝移植提供了技术和经验的参考。
关键词：肝移植；疾病模型，动物；器官移植

张清军，潘明新，孔凡东，姚坤厚，高毅.犬活体肝移植模型的建立及评价[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(5):809-812
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-809(ps).pdf]

中图分类号: R657.3
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)05-00809-04

Establishment and evaluation of living donor liver transplantation models in dogs

AIM:Dog living donor liver transplantation superficially resembles the clinical experiment, and can simulate the whole process of clinical living donor liver transplantation. This article establishes an animal model of living partial liver transplantation without veno-venous bypass in dogs.
METHODS: ①Experiments were conducted in the Animal Institute of Nanfang Hospital Affiliated to Southern Medical University between May 2006 and April 2007. Thirty-six healthy hybrid dogs were selected. Animal intervention met the animal ethical standard. ②These dogs were randomized into 2 groups (18 as donors and 18 as recipients). Eighteen times living donor liver transplantation was performed under non-bypass flow condition. Standard Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ left hepatic lobectomy was performed in living donor group. For recipient group, the recipient dogs underwent two steps total hepatectomy: Firstly, the segments Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳand Ⅴ were resected. After the donor liver graft was then transplanted in an orthotopic position, the segments Ⅵ and Ⅶ were resected. ③Operation time, blood loss amount, blood transfusion amount and survival phase were determined. Dead dogs received autopsy to define the cause of death.
RESULTS: Fourteen dog models after non-bypass living donor liver transplantation were successfully established. ①Operation results of living donor group: One dog died during the operation, one dog died of bleeding on the first day after operation. The survival rate was 88.2% 5 days after the surgery. The mean operative time, amount of blood loss and amount of blood transfusion during the operation were (183.7±32.4) min, (78.5±12.8) mL, 0 mL, respectively. Warm ischemia time was zero and the average of cold ischemia time was (146.7±24.4) min. ②Recipient group: Four out of 18 dogs died intraoperatively including 2 surface wound bleeding, 1 left hepatic veins stoma bleeding and 1 acute pulmonary edema. The survival rate was 85.7% 5 hours after the surgery. The mean operative time, anhepatic phase, amount of blood loss and amount of blood transfusion during the operation were (276.7±34.1) min, 0 min, (242.5±25.6) mL, (230.6±47.3) mL, respectively.
CONCLUSION: Dogs are appropriate animal model for living donor liver transplantation. Technique of two steps total hepatectomy in the recipient is feasible and may effectively sustain the systematic circulation of recipient. This model provides opportunity to develop techniques for living donor liver transplantation in clinic.

Zhang QJ, Pan MX, Kong FD, Yao KH, Gao Y.Establishment and evaluation of living donor liver transplantation models in dogs.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(5):809-812(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-809(ps).pdf]

活体肝移植目前已被公认为最有希望解决全球供肝来源短缺的技术方法[1-2]，建立器官移植的大动物模型是开展器官移植工作的前提和进行基础研究工作的平台。为此，本实验应用非体外转流和分流方法建立犬活体肝脏移植模型，探索建立大动物活体肝脏移植模型成熟稳定简易的方法，并希望训练一组合格的活体肝脏移植手术人员，使活体部分肝移植术应用于临床治疗。

设计：以动物为实验对象，自身配伍设计。
单位：南方医科大学珠江医院肝胆外科。
材料：实验于2006-05/2007-04在南方医科大学南方医院动物研究所完成。选用健康本地杂种犬36只，犬龄五六个月，体质量15~17 kg，雌雄不拘。将动物按随机数字表法分为供体组和受体组，每组18只，共行非转流条件下犬活体肝脏移植手术18对次。动物实验方法符合动物伦理学要求。
设计、实施、评估者：实验设计、实施、评估为本文全部作者，所有人员均经过正规培训，实施过程未采用盲法评估。
方法：实验犬均于术前24 h禁食，12 h禁水。静脉注射30 g/L戊巴比妥钠(0.5~1 mL/kg)，犬取平卧位，手术台上铺电热垫，调节加热垫温度，使其肛温保持在37~38 ℃之间(犬正常体温38.5~39.5 ℃)。固定头部和四肢，气管内插管，麻醉机维持呼吸。颈部左侧旁正中切口，于颈外静脉和颈内动脉内插管，分别建立补液通路，动、静脉压监测。采用上腹部肋缘下一横指“人”字型切口。进腹后，切断接扎肝圆韧带，切断肝镰状韧带和左右三角韧带。
供肝切取（见图1）：显露肝门，解剖第一肝门部：解剖胆管，在左右肝管分叉处断离左肝管，保留完整的右肝血管及胆管。游离肝固有动脉，肝总动脉至其自腹腔干起始处，切断此过程中部分分支：胃十二指肠动脉，肝固有动脉发向肝右三叶的分支，保留肝左四叶动脉血流供应，套7号丝线留做标记。解剖门静脉，分离出门静脉左右分支，在门静脉左支起始处套线，留做结扎。解剖第二肝门，游离出左肝静脉。离断左内侧叶与肝方叶之间肝脏组织，断面结扎止血。将门静脉左支在其起始处切断，近端结扎，远端插入导管，进行静脉灌注（以4 ℃乳酸林格液灌注）。将肝总动脉自腹腔干起始处切断，近端结扎；近下腔静脉壁切断肝左静脉，远端结扎，进端开放，留做灌注液出口。完全移去供肝，置入4 ℃盐水中备移植，继续灌注，肝周置冰屑辅助降温，灌注总液体量共约1 500 mL，肝脏均匀发白。
供肝修整（见图2）：左肝静脉、门静脉左支主干较短，无需过多修整。待确定为肝总动脉－肝固有动脉入肝，无其他迷走肝动脉及入肝血管后逐一结扎其他分支血管，并离断供肝上附着脂肪纤维组织，仅保留动脉及其外膜。门静脉保留冷灌注管，并继续持续行冷乳酸林格氏液体灌注，10滴/min。
受体手术：
受体肝脏部分切除：受体胆管的离断，肝动脉、门静脉、左肝静脉的游离同供体手术。左肝肝动脉、门静脉左支、左肝静脉离断结扎均靠近肝脏实质。在右内侧叶与肝方叶之间离断肝脏组织，断面结扎止血。完全移去左侧肝五叶，保留肝右外侧叶和尾状叶的乳头突。
新肝植入（见图3）：将供肝切好后用冰盐水纱布包裹，将供肝肝左静脉与受体肝左静脉以5/0 Prolene 线吻合，将肝门静脉左支与受体

门静脉左支分叉以6/0 Prolene 线吻合。迅速解除左肝静脉和门静脉左支间阻断钳，恢复门静脉血流，观察肝脏灌注情况，同时用纱布压迫肝脏断面，对于较大的出血点缝合止血。确定无活动性出血后，用8/0 Prolene 线在2.5倍显微镜下仔细将供肝肝总动脉与受体肝总动脉端端吻合。供肝的左肝管与受体胆总管行套管法重建，不放置T管，腹腔放置烟卷引流。

残留肝脏切除：游离出受体门静脉右支，在近肝实质处给予切断接扎。解剖第二肝门。切断接扎第一肝门与第二肝门之间汇入下腔静脉的肝短静脉，去除残留肝脏，创面止血。
检测动物手术时间、术中失血量、输血量及动物存活期；犬死后当天行尸体解剖明确死亡原因。
主要观察指标：动物手术时间、术中失血量、输血量及存活期。
统计学分析：由第一作者应用SPSS 10.0软件进行数据处理，计量资料采用_x±s表示。

2.1 实验动物数量分析 36只杂种犬纳入实验，成功建立非转流犬活体肝移植模型14只。
2.2 犬活体肝移植手术的基本情况活体供肝组18只：供体术中死亡1只，术后第1天因出血死亡1只，术后5 d存活率88.2%。手术时间（183.7±32.4） min，失血量为（78.5±12.8） mL，输血量0 mL，供肝的热缺血时间几乎为零，冷缺血时间平均（146.7±24.4） min。
受体组犬18只：术中死亡4只，其中创面出血2只，左肝静脉吻合口出血1只，1只死于急性肺水肿。术后存活14只，术后2 h内麻醉清醒，术后5 h存活率为85.7%；术后受体存活48 h为手术成功，动物处死；受体犬手术时间（276.7±34.1） min，无肝期0 min；失血量为（242.5±25.6） mL，输血量（230.6±47.3）mL。

目前活体肝移植已被公认为最有希望解决全球供肝来源短缺的技术方法[1-2]。然而，训练一组合格的活体肝脏移植手术人员，所需时间很长，难度极大。因此建立活体肝器官移植的大动物模型是开展器官移植工作的前提和进行与移植相关基础研究的平台。
猪、犬为建立肝移植模型最常见的大动物，但犬肝的解剖结构更适宜于建立活体肝移植模型。其一，犬的肝脏共分为7个叶[3]：乳状突（Ⅰ）、左外叶(Ⅱ) 、左中央叶(Ⅲ) 、右方叶(Ⅳ) 、右中央叶(Ⅴ) 、右外叶(Ⅵ) 、尾状叶(Ⅶ)，呈花瓣状，各叶之间有明显分割，各主要管道的解剖大致与人体相似，易于完成肝叶的切取及管道的保留；其二，与猪肝解剖学比较，猪的肝组织完全包裹肝后下腔静脉，汇入下腔静脉的肝静脉支多达31 支，保留下腔静脉的条件下完整切除肝脏十分困难[4]。相反，犬肝脏未完全包裹下腔静脉，肝静脉支数目少，一一结扎各静脉支，可以在切除肝脏的同时完整保留下腔静脉；其三，左肝静脉粗大且单独汇入下腔静脉,其直径和长度完全可以满足肝静脉流出道的重建；其四，门静脉分支较早，左支主干直径和长度可以满足门静脉管道重建；其五，供体移植物为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ肝叶，约占全肝的43%，这样，术后供体不会由于残存肝组织过少发生肝功能衰竭，供肝达到标准肝体积的40%以上，避免了受体小体积移植物的发生[5-7]。所以非常适合作部分肝移植的动物模型。
由于犬对内脏瘀血的耐受能力较差，无肝期需采用体外静脉转流或门体静脉分流，因此，活体肝移植难度较高，世界范围内报道的数量有限。为克服犬胃肠道不能耐受长期瘀血的难题，在犬肝脏移植模型的制作中，国内外学者进行了多方面的研究。大体来说，手术方式主要分两种：一是需体外循环方式的模型建立[8]；二是不行体外循环，进行门体分流方式模型的建立[9-11]。但无肝期无论体外转流或门腔分流，都容易引起代谢性酸中毒、高钾血症、代谢紊乱，难以控制的低血压，导致受体死亡。在受体手术时，受体肝脏分两步切除，先切除受体左侧Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ叶肝脏组织切除，保留Ⅵ，Ⅶ叶肝组织及其门静脉血供（门静脉右支）和出肝血流（肝短静脉和肝右静脉），在新肝植入后，再切除Ⅵ，Ⅶ叶肝组织。只保留门静脉右支及其相应肝叶静脉流出道，不会引起门静脉压力的升高[12]。这样，就避免了胃肠道瘀血所带来的代谢紊乱问题。
活体肝移植另一个难题是在肝叶切除时的出血问题[13-14]。围手术期出血量被认为是肝移植后早期死亡率的最重要的一个危险因素。凝血功能障碍、不完善的手术止血、新肝植入再灌注后吻合口血液渗漏是出血的主要原因。在本实验中，供体肝叶的切除，离断肝实质时，采用彭氏多功能解剖器（POMD）手术器械，明显减少了离断肝实质时的出血问题；门静脉左支置管进行左半肝灌注同时，切断肝总动脉，等左半肝颜色略变白，再剪开左肝静脉流出道，这样就减少了供体血液的丢失。供体18例，失血量为（78.5±12.8） mL，无手术输血。受体肝叶切除时，先离断肝叶的血液供应，再应用彭氏多功能解剖器进行肝实质的离断。左肝静脉、门静脉左支重建采用5~6/0 Prolene 线吻合，精湛的血管吻合技术，精细操作，减少吻合口渗漏概率[15]。受体18例，其中创面出血2例，左肝静脉吻合口出血1例，失血量为（242.5±25.6） mL，输血量（230.6±47.3） mL。受体术中均给予输血100~400 mL，血液来自健康第三者杂种犬。
肝移植术后胆道的并发症是发生率高达10%~30%[16-17]，占病死率的10%[18]。目前临床肝移植采用的胆道重建方式主要有两种：胆总管-胆总管端端吻合和Roux-Y胆总管空肠吻合术[19]。犬左肝管较细，进行显微吻合操作困难，在模型建立中，作者借鉴猪肝移植胆道重建采用的套管法[20]，术后对实验犬在不同时间点进行解剖，未见胆瘘情况发生，没有胆道壁坏死出现，证明采用的这种胆道的吻合方法是切实可行的。此种吻合方式具有明显的优点，操作简单，近期效果确切，而且可以明显缩短手术的时间。
本实验采用的非体外转流条件下犬活体肝模型建立方法，具有手术方法简便，手术成功率高，是研究活体肝移植的理想大动物模型，不仅为临床活体肝移植提供了良好的实践训练，也为进一步开展大动物器官移植免疫耐受的研究奠定了坚实的基础。

1 Nadalin S, Malago M, Radtke A, et al. Current trends in live liver donation. Transpl Int 2007;20(4):312-330
2 Feng S, Si M, Taranto SE, et al. Trends over a decade of pediatric liver transplantation in the United States. Liver Transpl 2006;12(4):511-513
3 王太一，韩子玉. 实验动物解剖学图谱[M].沈阳：辽宁美术出版社，2000
4 Leng JJ, Dong JH, Han BL, et al. Xiaohua Waike 2004;3(3):181-184
冷建军,董家鸿,韩本立,等.巴马小型猪肝脏应用解剖学观察[J].消化外科,2004,3(3):181-184
5 郑数森. 肝脏移植[M].北京：人民卫生出版社，2001：130-135
6 Chung KY, Kim MS, Hoon Lee JH, et al. Live donor partial liver harvest for canine liver transplantation: development of an innovative technique for surgical training and research. Surg Today 2005;32:711-715
7 Dahm F, Georgiev P, Clavien PA. Small-for-size syndrome after partial liver transplantation: definition, mechanisms of disease and clinical implications. Am J Transplant 2005;5(11):2605-2610
8 Tokunaga Y, Zaima M, Tanaka K, et al. Orthotopic partial liver transplantation in dogs can be performed without cold perfusion of the donor liver. Evaluation of its feasibility in terms of energy metabolism. Eur Surg Res 1989;21(3-4):137-144
9 Yabe S, Nishizawz H, Egawa H, et al. Portal blood flow and liver regeneration in auxiliary partial ort hotopic liver t ransplantation in a canine model. Eur Surg Res 1999;31:83-92
10 Ye QF, Wen ZX, Zeng FJ, et al. Zhonghua Qiguan Yizhi Zazhi 1998;19(20): 156-158
叶启发，文志向，曾凡军，等.保留门静脉－腔静脉血流的肝移植实验研究[J]. 中华器官移植杂志，1998，19(20):156-158
11 Fu JB, Li L, Jia J, et al. Zhonghua Xiaoer Waike Zazhi 2005;26(4):211-214
付京波,李龙,贾钧,等.犬部分肝移植模型的实验研究[J].中华小儿外科杂志，2005,26(4):211-214
12 Yu ZY, Wang SG, Yang ZY, et al. Xiaohua Waike 2005;4(6):435-438
喻智勇,王曙光,杨占宇,等.改良犬原位背驮式肝移植的解剖学观察[J].消化外科，2005,4(6):435-438
13 Peng CH, Shi LB, Zhang HW, et al. Establishment of a new pig model for auxiliary partial orthotopic liver transplantation. World J Gastroenterol 2005;11(6):917-921
14 Hashimoto T, Kokudo N, Orii R, et al. Intraoperative blood salvage during liver resection: a randomized controlled trial. Ann Surg 2007;245(5):686-691
15 Shirouzu Y, Kasahara M, Morioka D, et al. Vascular reconstruction and complications in living donor liver transplantation in infants weighing less than 6 kilograms: the Kyoto experience. Liver Transpl 2006;12(8):1224-1232
16 Pascher A, Neuhaus P. Bile duct complications after liver transplantation. Transpl Int 2005;18(6):627-642
17 Giacomoni A, Lauterio A, Slim AO, et al. Biliary complications after living donor adult liver transplantation.Transpl Int 2006;19(6):466-473
18 Pascher A, Neuhaus P. Bile duct complications after live transplantation. Transpl Int 2005;18(6):627-642
19 Kasahara M, Egawa H, Takada Y, et al. Biliary reconstruction in right lobe living-donor liver transplantation: Comparison of different techniques in 321 recipients. Ann Surg 2006;243(4):559-566
20 Xie JM, Pan MX, Zhang HY, et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2007;11(4):61
谢金敏,潘明新,张会迎,等.非转流小型猪原位肝移植模型的建立及评价[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(4):61