肾脏移植物血管内皮细胞替代现象*☆

柏宏伟1，曾瑄2，钟定荣2，石炳毅1，钱叶勇1，那彦群3，武莎菲2

课题背景：课题在北京市首都医学发展科研基金的资助下观察肾脏移植物穿刺活检标本中血管内皮细胞被受体内皮细胞替代（内皮嵌合）的情况，分析内皮替代现象的影响因素。

应用要点：文章观察肾脏移植物血管内皮细胞被受者细胞所替代的现象，分析其相关因素，并对血管内皮细胞嵌合现象与免疫耐受的关系进行了初步探讨。初步认为血管内皮细胞替代的发生与排斥反应无明显相关性，但与冷缺血时间有关。

同行评价：文章通过观察移植肾穿刺活检标本中血管内皮细胞嵌合现象，分析内皮替代与排斥反应及冷缺血时间的相关性，有一定临床意义。

1解放军总医院第二附属医院全军器官移植中心，北京市 100091； 2中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院病理科，北京市 100730；3北京大学第一医院泌尿外科，泌尿外科研究所，北京市
100034

柏宏伟☆，男，1973年生，山东省枣庄市人，汉族，2006年北京大学医学部毕业，博士，副主任医师，主要从事肾脏移植的临床和基础研究。
baihw@sohu.com

通讯作者：石炳毅，博士生导师，主任医师，解放军总医院第二附属医院全军器官移植中心，北京市 100091 shibingyi@medmail.
com.cn

北京市首都医学发展科研基金课题(2005-3093)*

摘要
目的: 移植受者来源的内皮细胞出现在供者移植物中，替代原有的细胞，称为内皮替代，也称内皮嵌合。使用X，Y染色体探针通过荧光原位杂交法观察移植肾中血管内皮细胞被受体内皮细胞替代的情况，并分析内皮细胞替代的影响因素。
方法：①收集解放军总医院第二附属医院病理科和北京大学医学部病理系1996-01/2005-12归档的移植肾穿刺活检符合男性供者、女性受者的石蜡包埋标本34例。②选择Y染色体长臂Yq12区域(异染色质区)DNA片段作为探针，同时选择X染色体着丝粒区(α卫星DNA探针作为对照，通过在石蜡切片标本上进行间期细胞双色荧光原位杂交法，观察移植肾穿刺活检标本的内皮替代现象，分析其与排斥反应及冷缺血时间的关系。
结果：①肾脏移植物中血管内皮细胞替代现象存在较为普遍，17例移植肾出现内皮细胞替代。②血管内皮细胞替代的发生与排斥反应无明显相关性（P > 0.05）。③发生内皮细胞替代的移植肾冷缺血时间长于无替代移植肾（P < 0.05）。
结论：内皮细胞替代与排斥反应的发生无明显关系，移植肾冷缺血时间延长可促进血管内皮细胞替代的发生。
关键词：肾移植；移植物排斥；原位杂交，荧光；内皮/细胞学

柏宏伟，曾瑄，钟定荣，石炳毅，钱叶勇，那彦群，武莎菲. 肾脏移植物血管内皮细胞替代现象[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(5):813-816 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-813(ps).pdf]

中图分类号:R657.3
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)05-00813-04

AIM:Endothelial chimerism refers to endothelial cells from recipients replace original cells. This study investigated endothelial chimerism and its influential factors with X and Y chromosome probes by fluorescence in situ hybridization.
METHODS: ①Paraffin-embedded 34 samples (male donor and female recipient) undergoing renal needle biopsy were selected at the Department of Pathology of Second Affiliated Hospital of General Hospital of Chinese PLA and Department of Pathology of Medical College of Peking University from January 1996 to December 2005. ②DNA section of Yq12 (heterochromatic region) of Y chromosome was considered a probe, and a probe of centric region (α satellite DNA) of X chromosome was considered a control. Paraffin-embedded tissue sections of renal biopsy samples were examined by two-color fluorescence in situ hybridization to observe the endothelial chimerism and analyze the relationship with rejection and cold ischemia time.
RESULTS: ①Endothelial chimerism was common in renal transplantation. Seventeen cases developed endothelial chimerism. ②There was no significant correlation between endothelial chimerism and rejection (P > 0.05). ③The cold ischemia time in the chimerism group was longer than in the non-chimerism group (P < 0.05).
CONCLUSION: No correlation is found between endothelial chimerism and graft rejection. Prolonged cold ischemia time enhances the occurrence of endothelial chimerism.

Bai HW, Zeng X, Zhong DR, Shi BY, Qian YY, Na YQ, Wu SF. Endothelial chimerism in renal allograft.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(5):813-816(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-813(ps).pdf]

移植受者来源的内皮细胞出现在供者移植物中，替代原有的细胞，称为内皮替代，也称内皮嵌合。移植物中血管内皮细胞嵌合现象影响因素众多，与排斥反应的关系目前也无定论。本文就这一问题在性别错配（男性供者、女性受者）的移植肾穿刺活检标本中使用X，Y染色体探针应用荧光原位杂交的方法观察移植肾中血管内皮细胞被受体内皮细胞替代的现象，分析其与急性排斥反应和冷缺血时间的关系。

1 对象和方法

设计：病例分析。
单位：解放军总医院第二附属医院全军器官移植中心。
对象：收集解放军总医院第二附属医院病理科和北京大学医学部病理系1996-01/2005-12归档的移植肾穿刺活检符合男性供者、女性受者的石蜡包埋标本34例，年龄21~54岁，平均（34±15）岁；穿刺时间从术后2周~4个月，临床资料齐全。制作4μm切片，苏木精-伊红染色，由两名副高以上病理医师用光镜下复诊确定诊断，诊断依据根据参照BANFF 97标准[1]。同时制备未染色的4 μm石蜡切片用于荧光原位杂交分析。实验方法符合医学伦理学要求。
设计、实施、评估者：设计、实施、评估均为本文作者，未采用盲法评估。
方法：
DNA探针的制备：常规方法提取质粒pBamX7（位于X染色体着丝粒区）和pY3.4 (位于Yq12异染色质区)DNA，采用缺口平移法，分别以地高辛(Digoxigenin-11-dUTP，购自Roche公司)和生物素(biotin-14-dATP，购自Sigma公司)进行标记（DNAploymeraseⅠ和DNaseⅠ购自TaKaRa公司）。DNA片段长度以200~300 bp为宜。
荧光原位杂交染色：具体荧光原位杂交步骤参见曾瑄等[2]的方法。以杂交缓冲液稀释地高辛和生物素标记的DNA探针，以Anti-Digoxigenine Rhodamine（Roche公司）和avidin-FITC（Vector公司）分别检测探针信号，若FITC显示的绿色信号较弱，可以再依次以生物素化的anti-avidin（Vector公司）和avidin-FITC进行信号放大，最后以DAPI（Sigma公司）对细胞核做对比染色。在荧光显微镜下，选择适宜的滤光片观察不同颜色的信号，用CCD分别采集图像，并以VideoTesT软件进行彩色合成，X染色体信号为桔红色，Y染色体信号为绿色。
主要观察指标：①移植肾血管内皮细胞嵌合现象与急性排斥反应的关系。②移植肾血管内皮细胞嵌合现象与冷缺血时间的关系。
统计学方法：由本文作者采用SAS 6.04软件包进行数据处理，血管内皮细胞替代出现情况以计数资料表示，冷缺血时间以计量资料表示，组间比较采用χ2检验和t检验。

2.1 肾穿刺活检结果与血管内皮细胞嵌合出现情况最早的穿刺活检在肾移植术后2周，此时即可看到血管内皮细胞嵌合现象，但随着移植术后时间的延长，至术后4个月内皮细胞嵌合比例并无增加趋势。以肾小管上皮细胞和间质中浸润的淋巴细胞为内对照，可见肾小管上皮细胞核内出现1个桔红色X染色体信号及1个绿色Y染色体信号，表示肾小管仍为供者起源。而间质中浸润的淋巴细胞肯定为受者起源，因为出现两个桔红色X染色体信号。本组34例穿刺活检患者中发现血管内皮细胞嵌合现象较为普遍，见表1。

2.2 移植肾血管内皮细胞嵌合现象与急性排斥反应的关系从急性肾小管坏死（无明显排斥反应证据）到间质性（Banff ⅠA/B）和血管性排斥反应（Banff ⅡA/B），均可见到受者来源的血管内皮细胞。而且内皮细胞的分布呈灶
状，见图1，供者内皮细胞和受者内皮细胞可相邻存在。经χ2检验，血管内皮细胞的嵌合的发生与排斥反应未能得出明显相关性（P > 0.05）。

2.3 移植肾血管内皮细胞嵌合现象与冷缺血时间的关系根据荧光原位杂交标记结果，回顾性分析移植肾中出现血管内皮细胞嵌合和无内皮细胞嵌合病例，归纳两组冷缺血时间，嵌合组为（14.83±4.03）h，无嵌合组为（11.27±3.87）h，经t检验，内皮细胞嵌合组冷缺血时间较无嵌合组长（P < 0.05）。

早在40年前就有人提出移植物中血管内皮细胞可以被受者来源内皮细胞所替代[3]，但由于当时技术方法的局限性，并未观察到移植物中有受者来源的内皮细胞的存在，所以通常认为实体移植物的内皮细胞仍保持供者来源。Lagaaij等[4]率先使用3个不同的方法研究肾脏移植物：免疫组化标记MHC-I类抗原，免疫组化标记ABO血型抗原，和原位杂交的方法标记性别错配受者的X和Y染色体。故ABO血型抗原的检测虽然简单，但在国内并不实用，因为绝大多数的移植都是同血型间移植。使用MHC单克隆抗体用免疫组化的方法因为受者白细胞表面的HLA分子可以脱落而被移植物的内皮细胞所吞噬，而使这种方法的灵敏度和特异度受到限制。本组使用荧光原位杂交的方法同时检测X和Y染色体，标本为形态结构十分完整的石蜡切片，可在苏木精-伊红染色确认组织结构的前提下直接分析所选区域内皮细胞的性染色体标记。该技术具有操作简便、快速，结果直观可靠，可进行存档标本的回顾性分析。
移植物中血管内皮细胞嵌合现象与排斥反应的关系目前尚无定论，一方面因为这方面的研究本来就较少，另一方面这类研究的病例数都普遍偏少。早先发现的血管内皮细胞嵌合现象主要发生在功能恶化和受损严重的肾脏移植物中[5-6]，因此被认为是移植物受损伤的一个标志，提示预后极差。而在1项关于长期存活（26~29年）的移植肾的研究却显示受者来源的内皮细胞广泛存在[7]，提示移植肾长期存活与内皮细胞的嵌合有关。距今较近的研究Lagaaij等[4]给出了相反的结论，在26例的移植肾穿刺活检病例中，发现肾小管周受者起源血管内皮细胞比例与排斥反应类型有显著相关性（r =0.71，P < 0.01），推测血管性排斥反应内皮细胞损伤后可以被受者内皮细胞修复。本实验中发现穿刺活检标本中血管内皮细胞嵌合现象较普遍存在，与细胞性或血管性排斥反应无明显关系。在排斥反应轻微、无排斥反应或急性肾小管坏死病例内皮细胞嵌合的现象也可存在，并无减少趋势。与 van Poelgeest等[8]新近观察到的结果类似，该作者使用免疫组化的方法，研究来自于24例“A”或“B”型受者接受“O”型供肾的受者的85个移植肾活检标本，发现内皮细胞嵌合现象与排斥反应无关。该文病例数虽不多，但标本量明显较Lagaaij等 [4]多，更加支持本文的观点。
Xu等[9]成功地建立一大鼠肾移植模型，研究内皮细胞嵌合现象及其与移植前缺血损伤、排斥反应严重程度、环孢素A毒性等因素的关系。有缺血损伤和环孢素A治疗组尽管排斥反应较轻，但内皮细胞嵌合体多见，接受缺血损伤但未行环孢素A治疗的大鼠内皮细胞嵌合化程度最高。缺血与嵌合形成的相关性最大，并且可能起协同作用。本组临床资料内皮细胞嵌合组冷缺血时间较无嵌合组稍长，提示皮细胞替代的出现可能是由缺血损伤有关，缺血损伤移植物内皮细胞，由此激发了修复机制，使受者的内皮细胞干细胞参与了新生血管内皮的发生。内皮细胞是供者和受者的接触面，细胞表面表达HLA分子，似乎整个内皮细胞全部被替代可以诱导免疫耐受或被宿主所“适应”，然而，达到这种程度前，供受者来源的内皮细胞应该彼此相邻共处，尚不能肯定这样是否能引发免疫反应。移植物内皮细胞被替代与排斥反应和免疫耐受的关系还需大样本、多中心的协同研究。

1 Racusen LC, Solez K, Colcin RB, et al. The Banff 97 working classification of renal allograft pathology. Kidny Int 1999;55:713
2 Zeng X, Zhao DC, Liu TH, et al. Zhonghua Binglixue Zazhi 2004;33（6）：523
曾瑄，赵大春，刘彤华, 等. 荧光原位杂交分析胰腺Y染色体丢失[J].中华病理学杂志，2004，33（6）：523
3 Medawar PB. Transplantation of tissues and organs: instruction. Br Med Bull 1965;21: 97
4 Lagaaij EL, Cramer-Knijnenburg GF, van Kemenade FJ, et al. Endothelial cell chimerism after renal transplantation and vascular rejection. Lancet 2001;357(9249):33

5 Slinclair RA. Origin of endothelium in human renal allografts. BMJ 1972;4:15
6 Williams GM, Haar A ter, Parks LC, et al. Endothelial changes associated with hyperacute and chronic renal allograft rejection in man. Transpl Proc 1973;5:819
7 Randhawa P, Starzl T, Ramos H, et al. Allograft surviving for 26 to 29 years following living-related kidney transplantation: analysis by light microscopy, in situ hybridization, and anti-HLA antibodies. Am J Kidney Dis 1994;24:72
8 van Poelgeest EP, Baelde HJ, Lagaaij EL, et al. Endothelial cell chimerism occurs more often and earlier in female than in male recipients of kidney transplants. Kidney Int 2005;68(2):847
9 Xu W, Baelde HJ, Lagaaij EL, et al. Endothelial cell chimerism after renal transplantation in a rat model. Transplantation 2002;74(9):1316