供肝冷保存再灌注过程中肝细胞、肝窦内皮细胞及枯否细胞损伤的比较**☆

宋燕1，孙振涛2，张弓1，李捷1，郑守华1，张水军1

课题背景：肝移植已成为各种终末期肝脏疾病的有效治疗方法。如何减轻供肝的缺血再灌注损伤，一直是研究的热点。课题建立封闭群大鼠同种异体原位肝移植模型，观察对比银杏叶提取物、左旋精氨酸及不同缺血预处理模式对供肝冷缺血再灌注损伤的保护作用。

应用要点：文章探讨了不同冷保存再灌注时间下移植肝脏肝细胞、肝窦内皮细胞及枯否细胞的损伤情况，发现肝窦内皮细胞的损伤及枯否细胞的激活明显早于并重于肝细胞出现，为在冷保存再灌注损失防护过程中，针对肝窦内皮细胞及枯否细胞进行早期干预，从而减轻移植肝脏的冷保存再灌注损失提供了理论依据。这已在作者的其他课题中得到证实。

同行评价：肝移植术后出现原发性移植肝无功能和移植肝功能恢复延迟严重影响肝移植远期效果，其中冷保存及再灌注损伤是常见的原因之一。实验观察大鼠移植肝脏冷保存及再灌注损伤对肝细胞、肝窦内皮细胞及枯否细胞的损伤，并得出后两者的受损时间早于前者的结论，对于提高供体质量有着深远的意义。

郑州大学第一附属医院，1外科，河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室， 2麻醉科，河南省郑州市 450052

宋燕☆，男，1975年生，河南省南阳市人，汉族，郑州大学第一附属医院在读博士，主治医师，主要从事腹部脏器移植和血管疾病研究。
sy75_0@yahoo.
com.cn

通讯作者：张水军，博士，教授，博士生导师，郑州大学第一附属医院外科，河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南省郑州市，450052
zhangshuijun@
zzu.edu.cn

河南省杰出青年科学基金（9804）*；郑州大学优秀博士学位论文培育基金（2007年度）*

目的: 冷保存及再灌注损伤是决定移植物功能及受者存活率的重要因素之一，这与供肝冷保存再灌注过程中枯否细胞的活化及肝窦内皮细胞的损伤密切相关。建立大鼠同种异体原位肝脏移植模型，比较不同冷保存再灌注时间下供肝肝细胞、肝窦内皮细胞及枯否细胞的损伤情况。
方法：①实验于2005-12/2006-12在河南省实验动物中心及郑州大学第一附属医院肝移植实验室完成，实验方法符合动物伦理学要求。②选用Wistar大鼠63只，采用随机数字表法取7只大鼠为正常对照组，另外56只平分为供体组与受体组，两两配对后再分为供肝冷保存3 h，6 h，8 h和12 h组（每组供、受体各7只）。各冷保存组用4 ℃ Euro-collins液灌注和保存供肝，之后行同种异体原位肝移植。③于受体门脉复流后15，30，60 min检测各组大鼠肝窦内皮细胞损伤指标血清透明质酸、枯否细胞激活指标肿瘤坏死因子α含量及肝细胞损伤指标丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性；观察受体门脉复流后60 min移植肝肝细胞、肝窦内皮细胞及枯否细胞的超微结构变化。
结果：63只大鼠均顺利完成模型建立，术中无异常死亡。①各冷保存组在门脉复流后15，30，60 min血清透明质酸、肿瘤坏死因子α含量均高于正常对照组（P < 0.05），并且随冷保存时间延长依次升高。②各冷保存组在门脉复流后15 min血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性与正常对照组无显著性意义（P > 0.05）；在门脉复流30 min后血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性高于正常对照组（P < 0.05）。③冷保存3 h及6 h组肝细胞结构基本正常，冷保存8及12 h组出现结构变化；而各冷保存组中，肝窦内皮细胞均有损伤并较肝细胞为重，枯否细胞均有激活表现。
结论：供肝冷保存再灌注过程中，肝窦内皮细胞的损伤及枯否细胞的激活明显早于并重于肝细胞损伤。
关键词：肝移植；组织供者；器官保存；再灌注损伤；肝细胞；枯否氏细胞

宋燕，孙振涛，张弓，李捷，郑守华，张水军.供肝冷保存再灌注过程中肝细胞、肝窦内皮细胞及枯否细胞损伤的比较[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(5):823-826 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-823(ps).pdf]

中图分类号: R657.3
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)05-00823-04

Injury to hepatocytes, sinusoidal endothelial cells and Kupffer cells caused by cold preservation and reperfusion in rat liver donors

AIM:Cold preservation and reperfusion injury are crucial for graft function and recipient survival, which is closely related to the injury of sinusodial endothelial cells (SEC) and activation of Kupffer cells during different hepatic cold preservation and reperfusion period in rat liver donors. This study established rat models of homologous orthotopic liver transplantation and compare the injuries of hepatocyte, SEC and KC during different hepatic cold preservation and reperfusion period in rat liver donors.
METHODS: ①Experiments were performed at the Henan Experiment Animal Center and Liver Transplantation Laboratory of First Affiliated Hospital of Zhenzhou University from December 2005 to December 2006. Experimental procedures were accorded with the Animal Ethical Standards. ②Sixty-three Wistar rats were randomly allocated into cold preservation 3-hour group, cold preservation 6-hour group, cold preservation 8-hour group, cold preservation 12-hour group, 14 rats in each group, 7 as donors and 7 as recipients, and the 7 else was the normal control group. Liver grafts in cold preservation groups were flushed with and preserved in 4 ℃ Euro-collins solution, the cold preservation time was 3, 6, 8, and 12 hours, respectively. Then orthotopic liver transplantation was performed. ③At 15, 30 and 60 minutes after portal vein reperfusion, blood samples were obtained to determine alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), hyaluronic acid (HA) and tumor necrosis factor (TNF)-α. At 60 minutes after portal vein reperfusion, the ultrastructure of hepatocyte, liver SEC and Kupffer cells were observed.
RESULTS: All of the sixty-three rats were included in the final results, no death. ①At 15, 30 and 60 minutes after portal vein reperfusion, the levels of HA and TNF-α in cold preservation groups were significantly higher than in normal control group (P < 0.05); and the levels of HA and TNF-α were all increased gradually along with the prolongation of cold preservation. ②At 15 minutes after portal vein reperfusion, the level of ALT and AST in all cold preservation groups had no difference compare with those in normal control group (P > 0.05). But at 30 minutes, the levels of ALT and AST in all cold preservation groups were significantly higher than in normal control group (P < 0.05). ③There was almost no hepatocyte injury except in cold preservation 8-hour and 12-hour groups, but SEC injury appeared and Kupffer cells activated in all cold preservation groups, and the injury of SEC were more severe than in hepatocytes.
CONCLUSION: During cold preservation and reperfusion, the appearance of SEC injury and Kupffer cell activation is earlier and more severe than hepatocytes.

Song Y, Sun ZT, Zhang G, Li J, Zheng SH, Zhang SJ.Injury to hepatocytes, sinusoidal endothelial cells and Kupffer cells caused by cold preservation and reperfusion in rat liver donors.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(5):823-826(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-823(ps).pdf]

目前，肝移植患者的1年存活率已达到83%[1]，但仍有3.5%~7%的患者因出现原发性移植肝无功能而影响移植肝脏及受者的长期存活[2]。研究发现[3-6]，冷保存及再灌注损伤是决定移植物功能及受者存活率的最重要因素之一，这与供肝冷保存再灌注过程中枯否细胞的活化[7]及肝窦内皮细胞的损伤密切相关。应用大鼠同种异体原位肝脏移植模型，观察不同冷保存再灌注时间下供肝肝细胞、肝窦内皮细胞和枯否细胞的损伤情况，以期为肝移植过程中防护供肝的冷保存再灌注损伤提供理论依据。

设计：随机对照动物实验。
单位：郑州大学第一附属医院外科、麻醉科。
材料：实验于2005-12/2006-12在河南省实验动物中心（省级）及郑州大学第一附属医院肝移植实验室（院级）完成。选用健康Wistar大鼠63只，雌雄不拘，体质量200~250 g，购自河南省实验动物中心（许可证号：200030410）。术前禁食12 h，自由饮水。实验方法符合动物伦理学要求。
设计、实施、评估者：实验设计、实施、评估全部作者，均经过专业培训，采用盲法。
方法：采用随机数字表法取7只大鼠为正常对照组，另外56只平分为供体组与受体组，两两配对后再分为供肝冷保存3 h，6 h，8 h和12 h组（每组供、受体各7只），各组供肝冷保存时间分别为3，6，8和12 h。正常对照组仅做开腹关腹和游离肝脏，而不行肝脏移植。冷保存组用4 ℃Euro-collins液灌注和保存供肝，受体采用乙醚吸入麻醉。大鼠原位肝移植模型参照文献[8]二袖套法并加改良建立[9]。
标本采集及检测：各组受体鼠门脉复流后15，30，60 min，经受体下腔静脉抽取血样备用；电镜下观察各组受体鼠门脉复流后60 min肝脏超微结构。
主要观察指标：各组受体大鼠门静脉复流后血清透明质酸、肿瘤坏死因子α含量、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性及供肝肝细胞、肝窦内皮细胞和枯否细胞的超微结构变化。
统计学分析：由第一作者应用SPSS 10.0软件进行重复测量设计的方差分析、单因素方差分析及t检验, 所有数值变异均采用_x±s表示。

2.1 实验动物数量分析 63只大鼠均顺利完成模型建立，术中无异常死亡。
2.2 各组大鼠血清透明质酸含量测定结果见表1。
如表1所示，受体大鼠血清透明质酸含量在肝脏再灌注后15 min即刻升高，且随着供肝冷保存及再灌注时间的延长而进一步升高。
2.3 各组大鼠血清肿瘤坏死因子α含量测定结果见表2。
如表2所示，受体大鼠血清肿瘤坏死因子α含量在肝脏再灌注后15 min即刻升高，且随着供肝冷保存及再灌注时间延长而进一步升高。
2.4 各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶活性测定结果见表3。
如表3所示，受体大鼠血清丙氨酸氨基转移酶活性直到再灌注后30 min才出现升高，
且随着供肝冷保存及再灌注时间的延长而进一步升高。

如表4所示，受体大鼠血清天冬氨酸氨基转移酶活性直到再灌注后30 min 才出现升高，且随着供肝冷保存及再灌注时间的延长而进一步升高。
2.6 各组大鼠枯否细胞、肝窦内皮细胞及肝细胞的超微结构变化各供肝冷保存组中枯否细胞活化均较为明显，表现为细胞变圆，去极化，细胞皱缩，脱颗粒，失去伪足，胞内出现吞噬溶酶体和透明的空泡（见图1）。

各供肝冷保存组中，肝窦内皮细胞均有损伤性改变，并较肝细胞损伤重，表现为线粒体嵴消失、细胞器模糊，异染色质丰富、甚至出现胞核固缩、破裂（见图2）。

供肝冷保存3 h及6 h组肝细胞结构基本正常，供肝冷保存8 h组肝细胞出现线粒体嵴轻度变化，供肝冷保存12 h组出现线粒体嵴消失、胞浆空泡化等改变。

肝脏主要由实质细胞即肝细胞与非实质细胞组成，作为非实质细胞重要成分之一的肝窦内皮细胞不仅是管道的构成成分，而且在肝脏及全身血流动力学和代谢功能中起重要作用。
本实验观察到，受体门脉复流后15 min，血液中即能检测到标志肝窦内皮细胞损伤的高浓度的透明质酸[10-12]，以及枯否细胞激活后释放的肿瘤坏死因子α；而丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性在门脉复流后30 min才开始升高；门脉复流后60 min各实验组肝脏组织标本电镜下均能观察到肝窦内皮细胞的形态学损伤性变化和枯否细胞激活的征象，而肝细胞直到冷保存8及12 h后才出现损伤性改变，这表明供肝冷保存及再灌注的早期，枯否细胞就已经激活，肝窦内皮细胞出现损伤性改变，而肝细胞的损伤可能是枯否细胞激活和肝窦内皮细胞受损后的继发性改变，因此出现的相对较晚。研究发现，供肝冷保存较长时间后再灌注会出现两种明显的改变：肝内巨噬细胞-枯否细胞激活和肝窦内皮细胞失活[13-14]。激活的枯否细胞释放大量的肿瘤坏死因子[15]，促进肝窦内皮细胞与白细胞间的黏附，从而导致肝组织血液灌流量的明显下降和肝窦内皮细胞的大量失活、死亡[7,16]；生理状态下，肝窦内皮细胞合成并贮存糖原的能力很差，在肝脏保存-再灌注期间，肝窦内皮细胞对缺血缺氧所致的损伤表现得尤为敏感。随着冷保存时间的延长，肝窦内皮细胞贮存的糖原的会进一步耗竭，再加上移植后血液再灌注时所伴随的复氧、温度及pH值等的变化，均可引发大量肝窦内皮细胞的失活、死亡。失活、死亡的肝窦内皮细胞可完全与肝细胞脱离，引起微循环障碍，导致肝细胞缺血坏死。此外，肝窦内皮细胞损伤后，其黏附分子表达增高，白细胞与内皮细胞黏附、积聚、肝窦内血栓形成、肝窦阻塞、狭窄、肝组织灌流量明显下降；肝细胞的进一步缺氧致使中性粒细胞浸润加重，在肝细胞中游走，并释放氧自由基和多种酶，加重了肝细胞的损伤[15]。抑制肿瘤坏死因子α的释放，可以减轻肝脏的缺血再灌注损伤。
本实验结果表明，供肝冷保存再灌注过程中，枯否细胞的激活及肝窦内皮细胞的损伤明显早于并重于肝细胞出现，肝细胞的损伤需要一定的冷保存和再灌注时间后才出现。这为供肝肝细胞的损伤防护提供了时间上的可能性，如果能在供肝冷保存再灌注过程中对枯否细胞的激活及肝窦内皮细胞的损伤进行有效保护，则有助于改善移植术后供肝的功能，这一设想已在另一项研究[17-18]中得到证实。

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