浆细胞聚集性浸润在移植肾丢失中的作用：40例切除移植肾标本中CD138的表达*★

许亮，石炳毅，许晓光，韩永，王强，周文强，蔡明

课题背景：了解细胞性排斥、体液性排斥机制并诱导免疫耐受，降低或避免移植排斥的发生是目前移植免疫学家的主要工作重点。近年来对于体液排斥反应机制的研究逐步深入，肾小管周毛细血管C4d的阳性沉积已作为体液排斥反应的重要诊断标准之一。但由于补体具有的多种活化途径导致了C4d仍旧不能作为诊断体液排斥反应的金标准。然而，体液排斥反应由浆细胞分泌抗体激活补体介导产生，所以对于移植肾中浸润的浆细胞群是否分泌了抗体参与体液排斥，并是否导致预后较差是文章的研究重点。

应用要点：文章结果提示，浆细胞群在移植肾中的浸润与移植肾长期存活关系密切，新型抗CD20单克隆抗体美罗华已经成功地应用于多种B细胞性疾病如多发性骨髓瘤等。临床上若在难治性排斥反应移植肾组织活检中显示CD138浆细胞群聚性浸润，是否可通过应用美罗华阻止CD20 B细胞转化为浆细胞，从而提高移植肾的长期存活，值得进一步研究。

同行评价：文章通过检测切除移植肾组织中CD138的表达，分析浆细胞在移植肾组织中聚集性浸润与移植肾存活时间的相关性。立意较新，有一定的临床意义。

解放军总医院第二附属医院全军器官移植中心泌尿外科，北京市 100091

许亮★，男，1983年生，安徽省舒城县人，汉族，解放军总医院-军医进修学院在读硕士，医师，主要从事器官移植免疫学方面的研究。
xul351@sina.com

通讯作者：蔡明，博士，主任医师，解放军总医院第二附属医院全军器官移植中心，北京市 100091
caiming@
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摘要
目的: CD138是浆细胞表面特有的细胞标记，移植肾中浸润的浆细胞群是否分泌抗体参与体液排斥反应导致移植肾预后效果不佳？检测切除移植肾组织中CD138的表达，分析浆细胞在移植肾组织中聚集性浸润与移植肾存活时间的关系。
方法：选择1989-06/2006-12解放军总医院第二附属医院全军器官移植中心收治的因难治性排斥致移植肾切除患者40例作为移植肾切除组，移植术后因移植肾功能异常行常规穿刺活检患者20例为对照组，所有患者对治疗及实验方案均知情同意，且得到医院伦理道德委员会批准。应用CD138多克隆抗体对肾组织标本石蜡切片行免疫组织化学染色，检测CD138在两组中的表达情况；同时记录移植肾切除组患者移植肾的存活时间，分析CD138的表达与移植肾存活时间的关系。
结果：①移植肾切除组的移植肾组织中CD138阳性23例，占57.5%；对照组穿刺移植肾标本中CD138阳性3例，占15.0%，两组CD138阳性率差异存在显著性意义（P= 0.004 3）。②移植肾切除组中CD138阳性患者的移植肾存活时间低于CD138阴性患者（P= 0.033 8）。
结论：浆细胞在移植肾组织中聚集性浸润是影响移植物长期存活的危险因素。
关键词：肾移植；移植物排斥；抗原，CD；浆细胞

许亮，石炳毅，许晓光，韩永，王强，周文强，蔡明.浆细胞聚集性浸润在移植肾丢失中的作用：40例切除移植肾标本中CD138的表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(5):849-852
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-849(ps).pdf]

Role of plasma nodule infiltration in renal graft loss: Expression of CD138 in excised renal allograft in 40 cases

AIM:CD138 is a specific surface marker of plasmocyte, does the plasma nodules infiltrated in the renal grafts secrete antibody to participate in the rejection reaction of body fluid and result in the poor prognosis? This study was to analyze the expression of CD138 in renal allograft, and explore the correlation between the plasma nodules infiltration and the graft survival.
METHODS: From June 1989 to December 2006, 40 patients underwent allograft excision due to incurable rejection as excised group, and 20 patients with renal function temporary abnormality received routine puncture biopsy as control group were admitted to the Organ Transplantation Center in the Second Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital, and were all enrolled in this study. Informed consents were obtained from all the patients, and the experiment was approved by the hospital ethical committee. CD138 polyclonal antibody was used to conduct immunohistochemistry in paraffin section of excised renal tissues, and then detect the expression of CD138. Meanwhile, the long-term graft survival of the excised group patients was recorded, and the correlation between CD138 expression and graft survival was studied.
RESULTS: ①There were 23 specimens positive for CD138 in the excised group, accounting for 57.5%; 3 specimens (15.0%) in the control group were positive for CD138. CD138-positive expression rate exhibited a significant difference between two groups (P=0.004 3).②In the excised group, the graft survival in patients with CD138-positive expression was lower than that in the patients with CD138-negative expression (P=0.033 8).
CONCLUSION: Plasma nodules infiltration in renal allograft is a risk factor for the long-term graft survival.

Xu L, Shi BY, Xu XG, Han Y, Wang Q, Zhou WQ, Cai M.Role of plasma nodule infiltration in renal graft loss: Expression of CD138 in excised renal allograft in 40 cases.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(5):849-852(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-849(ps).pdf]

随着移植免疫学的进展，体液免疫在移植排斥中的作用得到了越来越广泛的认识[1]。2003年Banff移植病理会议正式将C4d在PTC中的特异性沉积列入体液排斥反应的Banff诊断标准[2]。浆细胞是分泌特异性抗体的直接细胞，也是体液排斥反应的直接效应细胞，其高亲合力的特异性抗体可直接参与体液免疫应答。国外已有研究表明，移植肾组织穿刺活检显示CD138阳性沉积的移植受者，其预后一般较差，与临床密切相关[3]。然而CD138在失功移植肾组织中的表达情况尚未见报道。因此本文选择解放军总医院第二附属医院器官移植中心40例因难治性排斥反应致移植肾失功的患者，通过对切除移植肾组织中CD138的表达分析，检测浆细胞在失功移植肾组织中的浸润情况，对于探讨其在移植肾丢失中的作用具有重要意义。

设计：病例对比观察。
单位：解放军总医院第二附属医院全军器官移植中心泌尿外科。
对象：选择1989-06/2006-12解放军总医院第二附属医院全军器官移植中心收治的因难治性排斥致移植肾切除患者40例作为移植肾切除组，男28例，女12例；年龄27~67岁，平均(39±10)岁；供受体HLA配型良好，PRA< 10%，CDC< 2%；手术冷缺血时间6~ 12 min，平均（8.2± 4.3） min，热缺血时间170~720 min，平均（417.3± 335.4）min。术后免疫抑制方案包括3组：吗替麦考酚酯+环孢素+类固醇激素19例，吗替麦考酚酯+他克莫司+类固醇激素7例，硫唑嘌呤+环孢素+类固醇激素14例。受者在治疗过程中未行免疫抑制方案更换。20例移植术后因移植肾功能异常行常规穿刺活检患者为对照组，男13例，女7例；年龄12~55岁，平均（23±9）岁；对照组经临床治疗后，移植肾功能均得以恢复。所有患者对治疗及实验方案均知情同意，且得到医院伦理道德委员会批准。
所有移植肾标本石蜡切片均由本院病理科提供，鼠抗人CD138单克隆抗体和即用型第二代免疫组化EliVisionTMplus广谱试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。
设计、实施、评估者：设计、实施、评估均为本文作者，均经过正规培训。
方法：
病历筛选：回顾性分析40份移植肾切除的患者病历，筛选标准为移植排斥致移植肾失功并行移植肾切除，并且不合并感染的病例，记录其移植肾存活时间，存活时间以术后移植肾工作到患者再次行血液透析为标志。
肾切除标本CD138的染色：采用EliVisionTMplus免疫组化试剂盒说明书操作步骤。石蜡切片脱蜡水化后，灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗，抗原修复，加入山羊血清封闭，加入鼠抗人CD138多克隆抗体37 ℃孵育 1 h，PBS冲洗，生物素化山羊抗兔IgG在37 ℃孵育20 min，PBS冲洗，加入试剂SABC在37 ℃孵育20 min，PBS冲洗后DAB显色。苏木精轻度复染，脱水，透明，封固。
CD138检测结果判定：移植肾间质中呈现弥漫的、强的、聚集性的染色判定为阳性；少量的、散在染色判定为阴性[4]。
主要观察指标：①两组患者中CD138的表
达阳性率。②CD138阳性表达与移植肾存活时间的关系。
统计学分析：由本文作者应用CHISS软件进行统计学分析，两组间CD138阳性表达差异采用双向无序卡方检验，CD138阳性表达与移植肾存活时间的生存分析采用Log-Rank检验。

2.1 CD138的免疫组织化学染色结果 CD138阳性的浆细胞呈弥漫性浸润，聚集成多个小到中等大小细胞团（见图1）。移植肾切除组的移植肾组织中，CD138阳性23例（57.5%）；对照组20例患者穿刺移植肾标本中，CD138阳性3例（15.0%）。

如表1所示，移植肾切除组患者中CD138阳性者23例，阴性17例；对照组中CD138阳性3例，阴性17例，运用卡方检验统计学分析，两组中CD138阳性表达率差异存在显著性意义（P﹤0.05）。
2.3 移植肾切除组患者移植肾的存活时间见表2。
如表2所示，40例移植肾存活时间最长为110个月，最短为2周，平均35个月。移植肾切除组中CD138阳性患者移植肾存活时间为（27.2±5.2）个月，CD138阴性患者为（50.7±6.9）个月，移植肾存活时间上CD138阳性患者明显低于CD138阴性患者（P=0.033 8）。

CD138本身是一种细胞黏附分子，具促进细胞增殖、细胞与基质及细胞与细胞黏附等多种功能[5]。CD138同时也为浆细胞表面特有细胞标记。浆细胞是B细胞分化的终末效应细胞，可分泌高亲合力的特异性抗体直接参与体液免疫应答。近年来，国外对于浆细胞在移植肾中的群聚性浸润，并导致其较差预后时有报道。本文通过对CD138在切除移植肾组织中的表达分析表明，失功移植肾中CD138的阳性浸润率为57.5%，大于半数，与移植肾功能一过性异常的穿刺对照组相比，具有显著性区别；另外移植肾切除组中，CD138阳性的移植肾存活时间明显减少，较CD138阴性移植肾的存活时间有显著意义。移植肾切除组CD138阳性23例中存活时间﹤5年者的移植肾为15例，明显多于存活时间﹥5年者的阳性数（8例）。此种现象可解释为，CD138阳性沉积预示着较差的预后，多数CD138阳性的移植肾，在5年存活时间以内便已失功。综合以上结果，作者认为CD138浆细胞在移植肾中的群集性浸润是影响移植物长期存活的重要危险因素之一。
关于移植肾中浸润的浆细胞群以怎样的机制来影响移植肾的长期存活，目前机制尚不明确。当前，特异性抗体被认为是体液免疫应答的直接效应因子，而作为抗体分泌细胞的浆细胞则是体液免疫应答的效应细胞[6-8]。本文结果显示，浆细胞可在部分移植肾组织间质中聚集性浸润，并与移植肾的长期存活有着密切关系，可引起移植肾较差的预后。传统的观念认为移植排斥的机制以细胞介导为主，并认为肾小管间质浸润的各种炎性细胞激活并释放细胞因子起关键作用[9]。而体液排斥反应的发生及机制则越来越受到国内外研究者的重视。作者认为浆细胞在移植肾局部的群集性浸润的可能作用是浆细胞群在局部分泌特异性抗体，从而引起体液性排斥反应，影响移植肾的预后。体液性排斥反应在移植排斥中占有重要位置，是影响移植物长期存活的高危因素之一[10]。同种异体抗体针对其作用的最初靶点，即与供者的上皮细胞上相应抗原结合后，通过4条不同的途径引起上皮细胞的损伤[11-12]。第一，抗原-抗体复合物可通过经典途径激活补体系统，形成攻膜复合体直接损伤上皮细胞。第二，补体系统被激活后，形成的可溶性补体片断可募集炎性细胞局部浸润并造成上皮细胞的损伤。第三，吞噬细胞可通过表达的补体片段的受体与沉积于上皮细胞的补体片段结合，发挥补体的调理作用，杀伤沉积有补体片段的上皮细胞。第四，补体非依赖的抗体介导的细胞毒性作用，如ADCC（Antibody depended cell mediated cytotoxity）作用。内皮细胞损伤后可引起血小板的活化，血栓形成，内皮细胞，平滑肌细胞增生，以及体液和/或细胞性的浸润，从而导致器官/组织的损伤[13]。
2003年Banff移植病理会议已将C4d在PTC的阳性沉积作为体液排异反应的诊断标准之一[14]。C4d作为补体活化过程中的裂解产物，能特异性的附着于PTC[15-17]，虽然C4d的免疫组化或荧光染色为体液型排斥的诊断提供了重要依据，但由于C4d沉积并不总是由抗体引发，补体活化具有的多种途径包括凝集素途径等因素[18]，不能完全认为浆细胞与体液排斥反应具有直接联系性。所以综上所述，是否移植肾中浸润的浆细胞群通过在局部分泌抗体的形式来活化并裂解补体，从而引起C4d在PTC的沉积，导致体液排斥的发生，还有待于后续实验的进一步研究。
新型抗CD20单克隆抗体美罗华（Rituximab），已经成功地应用于多种B细胞性疾病如多发性骨髓瘤等[19]，Tyden等[20]在某些ABO血型不相合的肾移植排斥病例中应用美罗华同样取得了较好的治疗效果。本文结果提示，临床上若在移植肾组织活检中显示CD138浆细胞群聚性浸润，是否可通过阻止应用美罗华来抑制CD20 B淋巴细胞的增殖和活化，并转化为浆细胞，从而提高移植肾的长期存活，值得进一步研究。

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