双侧供肾大鼠肾移植模型的建立☆

李沙丹，靳风烁，李黔生，朱方强，聂志林，霍文谦

课题背景：大鼠肾移植动物模型是免疫和移植相关研究的重要实验工具。国内自1980年起已有成功建模的报道，但由于手术复杂，难度大，大多是对原有术式作一定改良，如应用套管吻合法-袖套吻合法来建立供肾的循环。国内诸多改良术式并没有为国际上大多数研究者采用，原因在于虽然这些吻合方法可以明显提高吻合速度，减少热缺血时间，但血栓形成-吻合口狭窄等并发症增加，故不推荐为建模的血管吻合方法。

应用要点：作者采用国际推荐的术式，利用双侧肾脏同时做为供肾，并在此基础上优化术式及过程，简化实验步骤、降低实验成本、缩短手术时间，获得了稳定的双侧供肾大鼠肾移植模型。为进一步深入研究肾脏移植打下了坚实的基础，具有良好的科研应用前景。

同行评价：课题建立双侧供肾大鼠肾移植模型，观察分析其与单侧肾脏移植的差异，以达到节省实验费用、缩短手术时间的目的，为实验方法的改进。

解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所肾移植中心，重庆市 400042

李沙丹☆，男，1974年生，四川省内江市人，汉族，解放军第三军医大学在读博士，主治医师，主要从事泌尿外科、肾脏移植方面的研究。lishadan2005@ 163.com

摘要
目的: 大鼠肾移植动物模型是免疫和移植相关研究的重要实验工具，但即往的大鼠肾移植模型大多以单侧肾脏为供肾，手术时间较长，实验经济性不高。拟建立双侧供肾大鼠肾移植模型，并进行改良，以期缩短手术时间及实验费用。
方法：①实验于2007-05/08于大坪医院实验动物中心完成，实验方法符合医学伦理学要求。②共选用大鼠90只，按随机数字表法分为2组，双侧供肾组Wistar供体大鼠18只，SD受体大鼠36只，采用原位低温灌洗，同时取供者双肾作为供肾；单侧供肾组Wistar供体大鼠18只，SD受体大鼠18只，取供者左侧肾脏为供肾。③以硬膜外导管为支架行供肾静脉与受者肾静脉端端吻合，供肾动脉带腹主脉瓣与受者腹主动脉行端侧吻合，供肾输尿管膀胱瓣与受者的膀胱吻合。受者术中预置右侧肾脏血管体外结扎线，术后3 d结扎。④术后1，5，7 d由受体大鼠尾静脉分别抽取静脉血1 mL测肌酐。
结果：①双侧供肾组手术成功率为91.7%，大鼠死亡的原因主要为血管吻合口出血、感染、休克、血栓形成以及膀胱漏尿致弥漫性腹膜炎等；单侧供肾组手术成功率为88.9%。②除取肾时间外两组其余手术耗时差异无显著性意义(P > 0.05)。③两组受体大鼠组内比较术后血肌酐含量均持续升高（P < 0.01），两组差异无显著性意义（P > 0.05）。
结论：双侧供肾大鼠同种异体肾移植模型建立方法可靠、稳定，并能降低实验成本，缩短手术时间。
关键词：肾移植；疾病模型，动物；组织供者；器官移植

李沙丹，靳风烁，李黔生，朱方强，聂志林，霍文谦.双侧供肾大鼠肾移植模型的建立[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(5):853-856 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-853(ps).pdf]

中图分类号: R692
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)05-00853-04

AIM:Rat model of renal transplantation is important for immune and transplantation-associated studies. Unilateral donor kidney is predominant in previous rat modeling, but the surgery is long and not economic. This study established a modified rat model of kidney transplantation to shorten operation time and cost.
METHODS: ①The experiment was performed at the Animal Experimental Center of Daping Hospital from May to August 2007. The experimental procedure was accorded with medical ethical standards. ②Ninety rats were selected and randomly divided into 2 groups. In bilateral renal allografts group including 18 Wistar rats as donors and 36 SD rats as recipients, two renal allografts were harvested from the donor at the same time after flushed with lactated Ringer solution in situ at low temperature. In unilateral renal allograft group including 18 Wistar rats as donors and 18 SD rats as recipients, only left kidneys of Wistar rats were harvested as grafts. ③With the assistance of Epidural catheter, venous anastomosis of the renal vein of donor and recipients was performed using interrupted sutures in an end-to-end pattern. A patch of aorta attached to renal artery of the donor was sutured to aorta of the recipient with end-to-side anastomosis. Extracorporeal ligation of the right renal vessels was applied 3 days after transplantation. ④1 mL blood was harvested from rat tail vein 1, 5 and 7 days after transplantation to determine creatinine.
RESULTS: ①Operation success rate in bilateral renal allografts group reached 91.7%. Rats died of artery anastomosis hemorrhage, thromboembolia, infection and diffuse peritonitis caused by urine leakage. The success rate in unilateral renal allograft groups was 88.9%. ②Except for time for kidney removal, there was no significant difference in operating time between two groups (P > 0.05). ③Postoperative creatinine was significantly elevated in each group compared with before operation (P < 0.01), but there was no significant difference between two groups (P > 0.05).
CONCLUSION: This model of harvesting two renal allografts from one donor simultaneously is a reliable and feasible method. Moreover, it can reduce experiment cost and save operating time.

Li SD, Jin FS, Li QS, Zhu FQ, Nie ZL, Huo WQ.Establishment of a rat model of bilateral renal allograft.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(5):853-856(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-853(ps).pdf]

建立动物模型是肾移植研究的重要内容，大鼠肾移植已广泛应用于器官移植及免疫学相关实验研究[1-3]。但即往的大鼠肾移植模型大多以单侧肾脏为供肾[4-5]，手术时间较长，实验经济性不高。作者借鉴前人的经验[6-9]，分析大鼠局部解剖结构[10]，经过多次实验，充分利用大鼠的双侧肾脏，建立了稳定的双侧供肾大鼠肾移植模型，并进行适当改良，缩短了手术时间及实验费用，为进一步深入研究肾移植打下了基础。

设计：随机对照动物实验。
单位：解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科肾移植中心。
材料：实验于2007-05/08于大坪医院实验动物中心完成。共选用大鼠90只，体质量250~300 g，其中36只Wistar大鼠为供体，雌雄不限；54只雄性SD大鼠为受体，均由解放军第三军医大学大坪医院实验动物中心提供（许可证号：SCXK-(军)2002-008）。温暖通风条件下普通饲料喂养。实验方法符合医学伦理学要求。主要仪器：双人双目手术显微镜（杭州医用光学仪器厂）、显微外科手术器械（宁波医疗器械厂）、医用8/0锦纶无损伤缝合线（上海浦东金环医疗用品有限公司生产）、硬膜外导管(外径1.0 mm)、自制S拉钩、常规手术器械等。药品：器官保存液（4 ℃，乳酸钠林格氏液）、25 U/mL肝素等渗盐水、速眠新、注射用青霉素20万U等。
设计、实施、评估者：设计、实施、评估均为本文作者，均经过正规培训。
方法：将90只大鼠按随机数字表法分为2组：①双侧供肾组Wistar供体大鼠18只，SD受体大鼠36只，采用原位低温灌洗，同时取供者双肾作为供肾。②单侧供肾组Wistar供体大鼠18只，SD受体大鼠18只，取供者左侧肾脏为供肾。
术前处理：供受者术前12 h禁食不禁水，术野备皮，速眠新肌肉注射麻醉(1 mL/kg)，肝素125 U，肌肉注射。
供者手术：麻醉成功后腹部备皮，20 g/L碘伏常规消毒，进行清洁手术。取腹部大十字切口进入腹腔，由剑突至耻骨联合。进腹后以自制S拉钩将腹壁拉开，将肠管推向右侧，并用盐水纱布覆盖减少体液丧失。另用1块覆盖于肝下和胸部，并将左肾向下推开少许，此纱布同时也可以起保护切口的作用，位于腹腔内的纱布以盐水湿润。在10倍手术显微镜下，用显微镊子撕剥开覆盖于肾动脉、静脉的腹膜，分离肾动脉、静脉，充分暴露左肾及左肾动、静脉、下腔静脉、腹主动脉、左肾上腺静脉及左生殖腺静脉。于肾静脉下方向下游离左输尿管，直至膀胱，暴露输尿管膀胱连接处。同法暴露对侧输尿管与膀胱连接处，并向上游离右输尿管至右肾下缘水平。游离膀胱,直至尿道,于尿道近端离断膀胱。以输尿管开口为中心切取半径2.0~3.0 mm的膀胱瓣（图1）。结扎门静脉，游离两侧肾脏。钝性分离腹主动脉和下腔静脉，分别于右肾动脉上方1 cm和左肾动脉下方2 cm用两把血管夹将主动脉和下腔静脉一并夹闭，左肾静脉下方的下腔静脉剪一小口以利引流灌洗液。于两把血管夹之间，左肾动脉下方约1 cm的腹主动脉插入静脉留置针头，以4 ℃含肝素(25 kU/L) 的生理盐水灌洗肾脏，灌注压力2.66~3.32 kPa [0.8 mL/(g·min)]，至双肾静脉流出液清亮为止，迅速用冰屑覆盖双肾。以肾动脉入口为中心，将腹主动脉剪成约3 mm×2 mm 的椭圆形动脉瓣。齐肾上腺静脉及左性腺静脉处剪断左肾静脉，于右肾静脉汇入下腔静脉处剪断右肾静脉并修剪平齐。保留右肾静脉开口处的腔静脉上下各0.5 cm，将其修剪成右肾静脉的一部分。供肾置于盛有0~4 ℃肝素(25 kU/L)乳酸钠林格注射液的无菌乳胶手套中，放入冰箱保存。

供肾修剪：供肾置入装有4 ℃灌注液的无菌皿中，肾静脉腔内插入硬膜外导管约0.5~0.8 cm，用1/0 丝线结扎固定[4]。双侧肾脏同时修剪多余的腹主动脉（保留肾动脉开口附近的腹主动脉约2.0~3.0 mm，形成类椭圆形的腹主动脉瓣），修剪双侧肾静脉开口至平滑，并小心剔除多余的脂肪，以利吻合血管[11]（图2）。

受者手术：术前处理及麻醉同供者，常规消毒、铺巾、简单护皮。取腹部纵形切口进入腹腔，由剑突至耻骨联合。按供者的方法游离并显露左肾。结扎左肾动脉，近腔静脉处暂时夹闭左肾静脉，距肾门端0.5~1.0 cm结扎肾动脉，然后剪断肾蒂并摘除左肾，保留左肾静脉0.8~1.0 cm。肾脏称量并记录。用生理盐水冲洗肾动、静脉腔的残血。供肾置于受者左侧腹腔内，覆盖一层棉片，及时添加冰屑保持低温。先吻合静脉，将硬膜外导管置于供肾静脉与受者肾静脉之间，在导丝的支撑下，以8/0无损伤缝合针线均匀间断缝合，先缝吻合口右侧壁，然后调换两端缝线位置将吻合口扭转180°，再缝吻合口左侧壁，每侧缝4至5针。缝至最后时，以8字缝合法，缝合最后两针，留线暂不结扎，待拔出硬膜外导管后，经肾静脉吻合部位注入肝素生理盐水，随即拉紧结扎缝线。采用Fabre法，以8/0无损伤缝针线将供、受者腹主动脉行端侧吻合。缝至最后1针时吻合部位注入肝素生理盐水排空气体，缝合完毕后，去除肾静脉血管夹及腹主动脉阻断钳，可见移植肾迅速充盈，1 min左右去除吻合口周围棉球，观察输尿管蠕动排尿情况，检查吻合口无出血及狭窄后，将肾脏置于原位固定。以8/0无损伤缝合线行供、受者输尿管膀胱瓣与膀胱吻合。受者预置右肾血管体外结扎线，用直针引出腹腔并打结保留。将腹部脏器复原，注生理盐水两三毫升于腹腔内，腹部伤口全层连续缝合。术毕腹壁肌肉注射青霉素20万U。
术后处理：受者清醒后，即可进食。术后3 d，通过预置的体外结扎线结扎受鼠的右肾血管并再次肌注青霉素20万单位1次。术后1，5，7 d由尾静脉分别抽取静脉血1 mL测肌酐。
主要观察指标：两组大鼠肾移植手术耗时、移植肾功能及术后受者存活率。
统计学分析：由第一作者应用SPSS 12.0软件包进行统计学分析，组间比较采用独立样本的t检验。

2.1 实验动物数量分析手术后SD受体大鼠一般于30~60 min内清醒，当天能正常进食。双侧供肾组手术成功33例，死亡3例，成功率92%，其中1例死于麻醉过深导致的呼吸抑制，1例死于失血性休克，1例死于膀胱输尿管吻合口漏尿导致的腹腔感染。单侧供肾组手术成功16例，死亡2例，成功率89%，其中1例死于失血性休克，1例出现动脉吻合血栓死亡。
2.2 手术耗时双侧供肾组取肾耗时（32.0±3.4）min，移植手术耗时（42.6±5.2）min，供肾热缺血时间为（5.8±1.3）s，冷缺血时间为（19.3±3.9）min。单侧供肾组取肾耗时（20.0±2.7）min，移植手术耗时（44.7± 5.8）min，供肾热缺血时间为（5.8±1.4）s，冷缺血时间为（20.9±3.6）min。两组取肾时间差异有显著性意义（P < 0.01），其余耗时差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.3 移植肾功能见表1。

如表1所示，恢复血流后，所有的移植肾均在3~5 min开始泌尿。术后3 d结扎自体右肾后每天观察受者均有尿液排出，说明血管吻合成功，移植肾泌尿功能正常。两组组内比较术后血肌酐均持续升高（P < 0.01），两组差异无显著性意义（P > 0.05）。
2.4 术后受者存活率双侧供肾组共施行此术式36例，成功率达到91.7%。单侧供肾组手术成功16例，死亡2例，成功率88.9%。受者术后未用免疫抑制剂，存活均超过 7 d，7 d后解剖显示吻合口通畅，无血栓形成，移植肾红润、血供好、体积较正常肾脏明显肿大（图3）。双侧供肾组移植肾称重为（2.16±0.27） g，单侧供肾组为（2.23±0.38）g，两组移植肾质量差异无显著性意义（P > 0.05），但与正常肾脏质量（0.90±0.06）g（随机选取18只术中切除的受鼠左肾计算均值）相比明显增大（P < 0.01）。

器官移植模型动物的选择有很多[12-14]，但是大鼠模型由于相对简单、经济、便于饲养等原因，仍然是最佳的动物选择。1965年Fisher等[4]首次报道了吻合血管的大鼠肾移植模型，人们对该模型进行了技术更新和改进，但一些技术仍较复杂，并发症多或不尽合理。目前大鼠肾移植模型中静脉吻合多采用Fabre法缝合或Kamada法套扎[15-16]。
前者因供受者肾静脉壁过于菲薄，缝合时相互粘贴而使难度大，缝合时间长，易造成吻合口狭窄。后者虽简化了静脉吻合操作，但在吻合口处供体静脉突入受体静脉，不符合血流动力学要求，且容易形成血栓；此外，人工制作的Cuff 管内外径相差大，口径较大的供肾静脉穿过其内腔时很容易形成人为狭窄，同时套扎时也不易操作，难度大，无法1人进行操作。使用支架进行血管吻合时，静脉吻合时间大大缩短，而且简便、可靠。Pahlavan等[17]也认为采用套管吻合的方法明显增加吻合口狭窄及栓塞等并发症的发生率，不推荐应用于实验模型。置入硬膜外导管作为支架后，静脉壁被完全撑起，不必担心缝合到对侧静脉壁。动脉吻合采用Fabre连续缝合，方法成熟，但是应尽量减少阻断大动脉时间，否则被阻断动脉的原侧易出现血栓形成，另外适当的用肝素生理盐水冲洗可以有效的防止血栓的形成。
以往的大鼠肾移植模型大多采用单侧肾脏作为供肾[18-19]，而在移植临床上左右双侧肾脏都可以作为供肾。作者通过对大鼠双侧肾脏及腹主动脉、下腔静脉局部解剖结构的深入学习，在实验的基础上发现，用双侧肾脏同时作为供肾的方法手术难度和常规方法无明显差别，术后移植功能及存活时间无明显差异。根据大鼠局部解剖的特点，作者在取左肾时，对以往的方法作了一点改进，简化了手术程序：①不再对腹主动脉及下腔静脉分别用丝线进行结扎，而改用两把血管夹将主动脉和下腔静脉一并夹闭，左肾静脉下方的下腔静脉剪一小口以利引流灌注液。②由于左肾上腺静脉和左生殖腺静脉靠近下腔静脉，不再对以上两者分别进行结扎，而是直接进行肾脏灌注，至双肾静脉流出液清亮后，靠近左肾上腺静脉和左侧性腺静脉剪断左肾静脉。③剪断右肾静脉时，也无需保留一部分腔静脉，而是直接在离右肾静脉汇入腔静脉处截断腔静脉。④两侧肾动脉截取时均保留约3 mm×2 mm的椭圆形腹主动脉瓣。而且同时取双侧肾脏，仅需30 min 左右，与取单侧肾脏相比较，仅取单侧肾脏需时20~25 min，如再加上大鼠术前麻醉、备皮、消毒等时间至少需35~45 min。通过一系列简化改良，手术耗时明显减少，手术难度也减小，只需1位术者即可以独立操作完成整个手术过程。
此外，既往术者大都采取先分离肾脏，然后离断血管并灌洗供肾，最后分离输尿管和膀胱，这样会延长供肾在非低温状态下的缺血时间，不利于肾功能的恢复。本实验借鉴冯嘉瑜等[20]的方法，先分离输尿管和膀胱，在取好输尿管膀胱瓣后才开始分离供肾，这样可以最大限度的保护肾功能，结果全部受者均在血流恢复后3~5 min泌尿，证明血管吻合成功，移植肾泌尿功能良好。在取双侧输尿管时，解剖膀胱后，直视下以输尿管膀胱开口为中心，附带切取直径3.0~4.0 mm 的膀胱瓣，极大地保护了下段输尿管的血液循环。术后解剖未见明显移植肾、输尿管积水及吻合口缺血坏死。另外，本实验采取端端吻合的方式吻合肾静脉，吻合时不阻断腔静脉的血流，因此下肢不会发生回流受阻现象，不易出现静脉血栓等并发症。

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