课题背景：课题系重庆医科大学附属第一医院承担的重庆市科技计划项目“新型生物医学材料—羊膜的制备及临床前研究”的系列子课题之一。根据国家对医用生物材料/制品的相关规定，对羊膜进行规范化的制备、保存、并进行全面的临床前研究；研发出可供临床及科研使用的具有良好的生物安全性、稳定性和有效性的羊膜制品，符合国家对医用生物材料和三类医疗器械的要求。

应用要点：文章观察不同活性羊膜移植对兔眼角膜碱烧伤的治疗效果，并分析其生物活性成分作用。羊膜尤其是新鲜羊膜移植可以减轻眼表碱烧伤急性期的炎症反应，加速眼表的稳定和修复，但即使新鲜羊膜的移植效果优于现有的保存羊膜也不能完全取代保存羊膜。甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组保存了大部分羊膜中生物活性物质，能够取得较为满意的临床效果，乙醇保存羊膜由于所含生物活性物质被固定丧失了其生物学作用，移植后临床效果差。

同行评价：近年来羊膜在医学中的应用发展迅速，在眼科针对的都是常见病多发病，基层医院亦可开展。但羊膜的作用机制至今仍不清楚，该实验选用不同活性羊膜分组，建立动物模型，比较不同活性羊膜移植治疗角膜碱烧伤的效果，从一个方面反映了羊膜的作用机制。配合其母项目，评估不同活性羊膜制备的有效性，也成为鉴定羊膜制备的一种新的有效的方法。

重庆医科大学附属第一医院眼科，重庆市 400016

胡 柯★，男，1976年生，浙江省宁波市人，汉族，2005年重庆医科大学毕业，硕士，医师，主要从事眼表及角膜病方面的研究。
42222@qq.com

摘要
目的: 近年来羊膜移植成为治疗角膜碱烧伤较为有效的手段之一，但其生物学基础尚不完全清楚。观察不同活性羊膜移植对兔眼角膜碱烧伤的治疗效果，并分析其生物活性成分作用。
方法：实验于2004-01/07于重庆医科大学动物实验中心实验室完成，动物实验方法符合动物伦理学要求。①实验材料及分组：健康产妇剖宫产胎盘由重庆医科大学附属第一医院产科提供。选用新西兰大白兔45只，按随机数字表法分为5组（n =9）：新鲜羊膜组、甘油保存羊膜组、乙醇保存羊膜组、真空干燥羊膜组及对照组。②实验方法：于新鲜羊膜制备后24 h内，保存羊膜保存1个月后行羊膜移植。③实验评估：术后2~21 d每日、21 d后每3日观察眼表角膜透明度及新生血管生长情况；术后14，30，60 d行荧光素染色，观察角膜上皮的修复情况；术后2周、1个月、2个月行组织病理和透射电镜观察。
结果：白兔43只进入结果分析。①在角膜透明性及角膜上皮修复速度上新鲜羊膜组、甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组无明显差异，均明显优于乙醇保存羊膜组和对照组，乙醇保存羊膜组与对照组无明显差异。②在抑制新生血管方面，新鲜羊膜组明显优于甘油保存羊膜组及真空干燥羊膜组。
结论：真空干燥羊膜、甘油保存羊膜和新鲜羊膜移植后均能减轻眼表碱烧伤的炎症反应，促进角膜上皮修复。其中新鲜羊膜效果最好，可能与其较其他羊膜含有更多的生物活性物质有关。
关键词：羊膜/移植；烧伤，化学；保存，生物学

胡柯，赵敏，张琪，李鸿.新鲜羊膜及几种保存羊膜移植治疗角膜碱烧伤[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(5):857-860
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-857(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)05-00857-04

收稿日期：2007-09-11
修回日期：2007-11-17
(07-50-9-4967/G·Y)

Transplantation of fresh amnion and preserved amnion for corneal alkali burn

Abstract

AIM:Recently, amnion transplantation has been one of effective methods for curing corneal alkali burn, but its biomechanism is unclear. This study was to discuss the efficiency of different kinds of amnion on rabbit corneal alkali burn and to find the bioactive functions of the amnion.
METHODS: The experiment was carried out in the Central Laboratory of Experimental Animals at Chongqing University of Medical Sciences between January and July in 2004. All the disposals were in accordance with the ethical standard of animals.①Placenta from healthy puerperants underwent uterine-incision delivery were offered by Department of Obstetrics in the First Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences. A total of 45 New Zealand rabbits were used for corneal alkali burn models and divided into fresh amniotic membrane (FAM), glycerin preserved amniotic membrane (GPAM), vacuum xeransis amniotic membrane (VXAM), alcolhol preserved amniotic membrane (APAM) and control groups, every group had 9 rabbits.②The FAM was prepared within 24 hours, and the preserved amnion were transplanted after 1 month.③The corneal opacity and corneal neovascularization were observed everyday during days 2–21 after operation and once every three days after days 21; corneal fluorescein staining was conducted to observe the repair of corneal epithelium on days 14, 30, 60 after operation; 2 weeks, 1 month and 2 months after operation, we did histopathological examination and scanning electron microscope observation.
RESULTS: Forty-three rabbits were involved in the result analysis.①There were no significant differences in the corneal opacity and repair velocity of corneal epithelium among FAM, GPAM and VXAM, which were remarkably superior to APAM and controls. APAM group and control group had not distinct difference.②FAM had better effects on inhibiting corneal neovascularization than GPAM and VXAM.
CONCLUSION: After transplantation, VXAM, GPAM and FAM can all accelerate corneal epithelial healing and lighten inflammation. FAM containing more bioactive materials, plays best.

Hu K, Zhao M, Zhang Q, Li H.Transplantation of fresh amnion and preserved amnion for corneal alkali burn.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(5):857-860(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-857(ps).pdf]

0 引言

碱烧伤会造成眼表急性炎症，大量的胶原酶造成角膜融解，形成溃疡甚至穿孔，在炎症介质的作用下形成新生血管[1-2]。近年来羊膜移植成为治疗角膜碱烧伤较为有效的手段之一，但由于其生物学基础尚不完全清楚，不同学者的观点也不太一致，报道的效果也不尽相同[3]。本实验建立眼前段碱烧伤动物模型，通过比较各组不同活性的羊膜移植治疗眼前段碱烧伤的临床效果、组织病理学及电镜改变，从一个方面反映羊膜的作用机制。

1 材料和方法

设计：随机对照动物观察。
单位：重庆医科大学附属第一医院眼科。
材料：实验于2004-01/07于重庆医科大学动物实验中心实验室（一级实验室）完成。选用4月龄新西兰大白兔45只，清洁级，雌雄不限，由重庆医科大学动物实验中心提供（机构许可证号：scxk（渝）20020001）。健康产妇剖宫产胎盘由重庆医科大学附属第一医院产科提供。动物实验方法符合动物伦理学要求。
设计、实施、评估者：实验设计为第二作者，实施和评估为其余作者，所有作者均经过系统培训，未采用盲法评估。
方法：
羊膜的制备：
甘油保存羊膜：在中性硅玻璃瓶中注入1 000 g/L无菌纯甘油，尽量倒满，盖上橡皮塞，置入4 ℃冰箱中保存。24 h后取出换瓶，再加入1 000 g/L纯甘油，加盖后用1 mL注射器将瓶内残留气体吸出，瓶塞自动盖严。用标记日期，4 ℃保存1个月后使用[4]。
真空干燥羊膜：将小瓶去盖置于可调温真空干燥器中低温真空干燥1 h，保存1个月后使用（重庆医科大学药学系教研室协助制作）。
乙醇保存羊膜：在小瓶中注满体积分数为0.75的乙醇，置入4 ℃冰箱中保存。24 h后取出，在净化工作台上将羊膜片取出，置于另一灭菌的中性硅玻璃瓶中，加入体积分数为1的纯乙醇并加盖，用标记日期，4 ℃保存1个月后使用。
将45只大白兔按随机数字表法分成5组：新鲜羊膜组、甘油保存羊膜组、乙醇保存羊膜组、真空干燥羊膜组和对照组，每组9只，裂隙灯显微镜检查眼前段无病变。麻醉后将直径9 mm用1 mol/L NaOH溶液浸透的圆形滤纸贴于角膜中央30 s，立即用30 mL生理盐水冲洗(烧伤程度根据全国眼外伤职业眼病学组通过的烧伤标准)。对照组仅在烧伤24 h后剪除第3眼睑。移植组麻醉生效后沿角膜缘全周剪开球结膜，止血并刮除角膜表面坏死组织。除新鲜羊膜外，各组羊膜术前复水30 min，上皮面朝上铺于角膜表面，其边缘超出角膜缘约5 mm。用10/0缝线间断缝合固定于浅层巩膜（16针），后将球结膜缝回角膜缘，盖于羊膜之上。
临床观察及评分：术后2~21 d每日、21 d后每3日，裂隙灯显微镜观察兔眼表角膜浑浊、新生血管生长情况及羊膜植片贴附情况；术后14，30，60 d分别将兔全身麻醉，观察眼前段新生血管生长，并用25 g/L荧光素染色观察角膜区上皮的修复情况。
角膜浑浊程度的划分及评分[5]：0分：角膜透明，无浑浊；1分：Ⅰ度浑浊，透过角膜大致可见眼内结构；2分：Ⅱ度浑浊，宽裂隙下隐约可见前房结构；3分：Ⅲ度浑浊，窄裂隙下隐约可见眼内结构；4分：Ⅳ度浑浊，眼内结构不可见。
新生血管的划分及评分[6]：0分：无新生血管；1分：新生血管于角膜缘内2 mm；2分：新生血管位于角膜周边范围小于180°；3分：新生血管位于周边范围小于270°；4分：全角膜可见新生血管生长。
上皮荧光素染色评分标准[7]：0分：角膜无着色；1分：中央着色面积< 1/4；2分：中央着色面积为1/4~1/2；3分：中央着色面积 > 1/2~≤ 3/4；4分：中央面积全部着色。
组织病理与透射电镜标本制作与观察：各组分别于术后14 d，1和2个月，每组麻醉或处死2只兔，沿角膜缘将角膜取下分别置于100 g/L多聚甲醛溶液及25 g/L戊二醛中固定，按常规方法制作组织及电镜标本。
主要观察指标：不同活性羊膜移植后烧伤角膜的形态学变化、组织病理学改变及透射电镜观察结果。
统计学分析：数据由重庆医科大学统计教研室应用统计学程序软件包SPSS 11.0分析处理，计量资料采用_x±s表示，差异统计学意义采用单因素方差分析检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入新西兰大白兔45只，分为5组，43只进入结果分析，两只兔眼因穿孔脱失。
2.2 羊膜移植后烧伤角膜的形态学变化 角膜浑浊度：碱烧伤后兔眼角膜即刻出现肉眼可见的明显浑浊水肿，呈毛玻璃状，但仍可隐见虹膜及瞳孔。术后7 d内各组结膜充血均较明显（++~+++），新鲜羊膜组、甘油保存羊膜组、真空干燥羊膜组角膜呈Ⅲ度浑浊，虹膜隐约可见；乙醇保存羊膜组及对照组均呈Ⅲ~Ⅳ度浑浊，且各有1眼出现角膜融解变薄，并于术后20，23 d发生穿孔。新鲜羊膜组、甘油保存羊膜组、真空干燥羊膜组术后14 d角膜厚度较前变薄，水肿有所消退，但浑浊改变不明显。术后1和2个月角膜中央绝大部分变透明，角膜无感染、融解穿孔，无瘢痕形成。乙醇保存羊膜组和对照组术后14 d角膜中央均为白色混浊，部分出现溶解溃疡，乙醇保存羊膜组有1眼角膜感染，1眼融解穿孔，对照组有2眼角膜感染，1眼融解穿孔；术后30 d，乙醇保存羊膜组有1眼粘连性角膜大白斑，对照组有1眼萎缩，其余角膜中央白色浑浊，瘢痕形成；术后60 d角膜白斑形成。
角膜新生血管的生长情况：术后7 d各组均可见新生血管芽从角膜缘生长。术后12~20 d新生血管生长最为旺盛，顶端分叉相互连接成网状在羊膜下向角膜中央生长，乙醇保存羊膜组及对照组几乎满布整个角膜。此后新生血管停止生长，并开始不同程度消退，术后1个月时新鲜羊膜组血管明显较前稀疏，仅角膜缘3 mm内可见；甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组新生血管在角膜缘2~5 mm范围内呈稀疏毛刷状；乙醇保存羊膜组及对照组消退缓慢，大于3/4象限为角膜新生血管占据。术后2个月新鲜羊膜组新生血管肉眼下几乎不可见，甘油保存羊膜组及真空干燥羊膜组新生血管在角膜缘2 mm范围，乙醇保存羊膜组和对照组新生血管约占角膜面积的1/2，变为较粗大的血管交叉迂曲于角膜上。
角膜荧光素染色情况：术后14 d新鲜羊膜组、甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组角膜上皮有一定程度的修复，见片状着色；乙醇保存羊膜组与对照组角膜表面广泛着色，可见局部溃疡形成。术后1个月，新鲜羊膜组、甘油保存羊膜组、真空干燥羊膜组角膜上皮基本修复，仅可见角膜中央区少许点状着色。乙醇保存羊膜组与对照组修复仍差，多呈片状着色。术后2个月5组表面着色均不明显。
2.3 组织病理学改变 术后14 d时乙醇保存羊膜组组角膜基质中有大量的中性粒细胞浸润，胶原纤维断裂溶解，角膜缘可见较密集的新生血管；甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组角膜下有中量的中性粒细胞浸润；而新鲜羊膜组角膜基质内中性粒细胞浸润最少，角膜缘可见少量新生血管。术后1个月时乙醇保存羊膜组和对照组仍有大量的中性粒细胞浸润，胶原纤维排列紊乱，基质内大量新生血管；甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组可见少许中性粒细胞浸润，角膜表面已有两三层上皮细胞覆盖；新鲜羊膜组炎性细胞浸润明显减少，其基底细胞呈柱状排列。术后2个月新鲜羊膜组、甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组角膜无炎症细胞，有较规则角膜上皮覆盖；乙醇保存羊膜组和对照组可见结膜杯状细胞，胶原纤维排列紊乱，基质内可见较粗大的血管。
2.4 透射电镜观察结果 术后14 d乙醇保存羊膜组和对照组角膜表面上皮细胞染色质聚集在核膜下，胞浆中溶酶体增加，线粒体高度肿胀；甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组细胞胞质形成褶被稀疏；新鲜羊膜组细胞器较丰富，胞质褶被较多，可见少许桥粒连接。术后30 d时乙醇保存羊膜组和对照组细胞质内溶酶体增多，细胞胞质褶被稀少；甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组角膜上皮细胞间隙较大，细胞器稀疏，桥粒连接清晰；新鲜羊膜组上皮表面微绒毛丰富且排列整齐，细胞边界较清晰。术后60 d 乙醇保存羊膜组和对照组胶原纤维增多，可见成纤维细胞；甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组基质内胶原纤维增多不明显。

3 讨论

角膜碱烧伤是常见的眼科急重症，由于碱性物质皂化细胞膜，反应后形成的化合物既溶于水又溶于脂，能很快穿透眼组织，碱与细胞成分形成的化合物容易溶解，最终导致细胞壁屏障的崩解。羊膜是半透明、光滑的薄膜状组织，主要由类似角膜的基底膜和无血管的基质构成。羊膜和角膜组织内均富含Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和Ⅶ型胶原。随着分子生物学研究的深入，人们发现羊膜具有无免疫原性、含有大量细胞因子和蛋白酶抑制剂等生物学特性[8-11]。临床发现羊膜具有抑制炎症、促进上皮细胞增殖和减轻新生血管化的作用，其作用机制尚不清楚，考虑可能与以下机制有关：羊膜光滑，可以作为一种生物半透膜覆盖在碱烧伤后的眼表面，有效的减轻角膜刺激症状，减少眼睑活动对角膜烧伤创面的再损伤；羊膜中所含的生物活性物质可以促进角膜缘干细胞的增生分化，加快角膜上皮的修复，能下调白细胞介素8、单核细胞趋化蛋白1等细胞因子的转译，减轻炎症反应，从而减少新生血管的生成，多种蛋白酶抑制剂抑制纤维母细胞的增生，减少瘢痕形成[12-18]。
本实验结果显示，在羊膜移植后各个时间段，在角膜透明性及角膜上皮修复速度上新鲜羊膜组、甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组无显著差异，但在后期新鲜羊膜组对角膜新生血管的抑制优于甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组。在角膜透明性、新生血管、上皮修复速度、细胞连接和细胞排列上甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组效果均优于乙醇保存羊膜组和对照组，乙醇保存羊膜组与对照组无显著差异。在组织病理标本中炎性细胞主要位于角膜基质浅层的1/3，较少位于基质深层，这与后期角膜新生血管的部位一致。新生血管形成主要是通过血管基底膜上酶的降解，内皮细胞的趋化、迁移，以及内皮细胞的有丝分裂使新生血管管腔形成，炎性细胞浸润是新生血管生成的前奏。新鲜羊膜组、甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组由于早期的炎性细胞减少，角膜上皮的修复加快，减少了刺激新生血管因子的产生，从而在后期减少了新生血管的生成。新鲜羊膜组在抑制炎性细胞浸润，减少新生血管上有着更强的作用可能与其含有比甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组更多的生物活性物质有关。乙醇保存羊膜组虽形态学接近正常，并持续存在于眼表，但不能取得预期的临床效果，可能与乙醇对蛋白质的固定作用使生物活性成分全部失活，不能发挥作用有关。结果提示羊膜中生物活性物质在移植中有重要的作用。透射电镜的观察结果可以看出术后30 d乙醇保存羊膜组和对照组上皮细胞形态不规则，表面微绒毛稀疏，细胞连接极少；新鲜羊膜组上皮细胞生长较紧密，表面较多微绒毛，胶原纤维排列整齐，甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组次之。术后60和90 d，乙醇保存羊膜组和对照组胶原纤维排列紊乱，仍有炎性细胞；甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组角膜上皮细胞间连接较紧密，胞质内细胞器稀疏，细胞间桥粒连接清晰，细胞表面有较丰富的微绒毛，形态规则。该结果证实了羊膜在治疗早期碱烧伤过程中有促进上皮细胞增殖、分化和移行的作用。新鲜羊膜移植术后角膜上皮细胞修复更加接近于正常组织。
通过本实验作者认为，羊膜尤其是新鲜羊膜移植可以减轻眼表碱烧伤急性期的炎症反应，阻止眼表的进行性溃烂和融解，加速眼表的稳定和修复；在烧伤初期减少炎症细胞浸润，进而减少角膜新生血管的形成，并将其局限在角膜周边部，对于严重的眼表烧伤可以为后续的角膜复明手术打下良好的基础。但是受取材时间及医院本身条件的限制，一些急诊手术病例及一些基层医院不能及时得到材料。而且在一些传染性疾病的潜伏期，供体虽具有传染性但血清学检查仍可以为阴性，因而新鲜羊膜的使用具有一定的安全隐患。即便新鲜羊膜的效果优于现有的保存羊膜也不能完全取代保存羊膜。甘油保存羊膜组和真空干燥羊膜组保存了大部分羊膜中生物活性物质，能够取得较为满意的临床效果，乙醇保存羊膜由于所含生物活性物质被固定丧失了其生物学作用，移植后临床效果差，推断羊膜移植的效果与其所含生长因子和酶类的种类数量有关。

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