γ-干扰素、白细胞介素4与CD25在角膜移植免疫排斥反应中的作用*☆

宫玉波1，陆晓和1，周瑾1，袁伟1，柯晓云1，崔国华2

课题背景：角膜移植免疫排斥反应是一个多因素参与的调节过程，近年来研究表明细胞因子在角膜移植免疫中起重要作用，角膜移植免疫排斥反应是主要由Th1因子介导的迟发型超敏反应。但也有研究表明，Th2因子亦与移植排斥有关，应用Th2因子抑制剂可延长移植器官的存活。

应用要点：目前临床上尚未出现针对角膜移植术后局部免疫状态变化、排斥反应发生、临床表现的早期诊断及发生排斥反应时免疫抑制治疗效果等的有效检测手段。因此进一步观察分析各种细胞因子间的相互作用及其在排斥反应发生前后的表达情况，不仅能为阐明角膜移植排斥反应机制提供理论基础，还将为临床尽早发现排斥反应并给予早期干预以降低角膜移植排斥率、提高存活率提供重要的辅诊检测手段。文章结果表明CD25、γ-干扰素和白细胞介素4在角膜移植免疫排斥反应过程中发挥重要的作用。

同行评价：文章观察了γ-干扰素（Th1因子）、白细胞介素4（Th2因子）及CD25等细胞因子在大鼠角膜移植术后排斥反应过程中局部及全身的表达情况，并分析其作用，具有一定的创新性，为临床治疗角膜移植术后排斥反应提供了实验依据。

1南方医科大学珠江医院眼科，广东省广州市 510282；2解放军第五二一医院眼科，吉林省白城市 137001

宫玉波☆，男，1974年生，山东省莱阳市人，汉族，南方医科大学在读博士，医师，主要从事角膜病的基础与临床研究。
gybo16@163.com

通讯作者：陆晓和，博士，博士生导师，主任医师，教授，南方医科大学珠江医院眼科，广东省广州市 510282 ykdzjh@sina.com

摘要
目的: 角膜移植免疫排斥反应是一个多因素参与的调节过程，近年来研究表明细胞因子在角膜移植免疫中起重要作用。实验拟验证γ-干扰素、白细胞介素4及CD25在大鼠角膜移植免疫排斥反应中的作用。
方法：①实验于2006-10/2007-05在南方医科大学南方医院实验动物中心完成。选用Wistar大鼠24只，SD大鼠54只，实验方法符合动物伦理学要求。②将54只SD大鼠按随机数字表法分为3组，正常组6只，角膜移植组及地塞米松组均24只。后两组制备Wistar→SD角膜移植大鼠模型，受体选择右眼手术，供体提供双眼角膜。③用裂隙灯观察移植排斥情况；利用反转录-聚合酶链反应检测植片内γ-干扰素、CD25 mRNA的表达；应用酶联免疫吸附实验检测房水和血清中γ-干扰素、白细胞介素4含量；应用流式细胞术检测移植前后不同时相外周血淋巴细胞CD25的表达；术后第11天，应用免疫组织化学方法检测角膜CD4+，CD8+和CD25+ T细胞的表达。
结果：54只SD大鼠全部进入结果分析。①地塞米松组大鼠发生角膜移植排斥反应的时间长于角膜移植组(P=0.000)。②正常角膜植片无CD25、γ-干扰素mRNA表达，角膜移植组术后第11天角膜植片内γ-干扰素、CD25 mRNA的表达较地塞米松组增强(P < 0.05)。③角膜移植组角膜移植术后6，11 d血清γ-干扰素含量高于正常组（P < 0.05）；术后11 d含量高于术后6，24 d（P < 0.01）；地塞米松组术后6，11 d低于同期角膜移植组（P < 0.05）。④角膜移植组角膜移植术后6，11，24 d房水γ-干扰素、白细胞介素4含量均高于正常组（P < 0.05）；地塞米松组术后6，11 d均低于同期角膜移植组（P < 0.05~0.01）。⑤地塞米松组术后6，11 d外周血CD3+CD25+T/CD3+T比值低于同期角膜移植组（P < 0.05）。⑥术后第11天角膜移植组植片内CD4，CD8及CD25明显表达，地塞米松组CD4，CD8及CD25表达明显减弱。
结论：CD25、γ-干扰素和白细胞介素4在角膜移植免疫排斥反应过程中发挥重要的作用；促进白细胞介素4表达，抑制γ-干扰素及CD25产生，对降低角膜移植免疫排斥反应具有积极的作用。术后动态检测外周血CD25和γ-干扰素的表达有助于临床了解局部免疫反应程度并预测角膜移植排斥反应的发生。
关键词：角膜移植；干扰素类；白细胞介素4；受体，白细胞介素2；移植免疫

宫玉波，陆晓和，周瑾，袁伟，柯晓云，崔国华.γ-干扰素、白细胞介素4与CD25在角膜移植免疫排斥反应中的作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(5):861-867 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-861(ps).pdf]

中图分类号:R394.2
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)05-00861-07

Effects of interferon-gamma, interleukin-4 and CD25 in rat corneal allograft immunological rejection

AIM:Corneal allograft rejection is a complicated adjusting process which multiple factors participate in. Recent researches showed that the cytokine plays an important role in corneal transplantation immunity. This study was designed to investigate the role of interferon (IFN)-γ, interleukin-4 (IL-4) and CD25 in the allograft rejection of rat penetrating keratoplasty (PKP).
METHODS: ①Experiments were performed at the Experiment Animal Center of Nanfang Hospital of Southern Medical University from October 2006 to May 2007. A total of 24 Wistar rats and 54 SD rats were selected. Experimental procedures met the animal ethical standards. ②The 54 SD rats were randomly divided into three groups, normal control group (n=6), corneal graft group (n=24) and dexamethasone group (n=24). Rats in the latter two groups received Wistar→SD corneal transplantation. Receptors received right eye surgery, and donors offered cornea of both eyes. ③Rejection reaction was observed with a slit lamp microscope. Levels of IFN-γand CD25 mRNA in grafts were detected by using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Aqueous humor and serum levels of IFN-γand IL-4 were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The expression of CD25 in peripheral lymphocytes was measured by flow cytometry (FCM) before and after surgery. Immunohistochemical method was performed to examine corneal CD4+，CD8+ and CD25+T expressions at day 11 after surgery.
RESULTS: Totally 54 SD rats were included in the final results. ①The rejection time was longer in the dexamethasone group than in the corneal graft group (P =0.000). ②There was no expression of IFN-γ and CD25 mRNA in the normal cornea. Compared to the dexamethasone group, the expressions of IFN-γ and CD25 mRNA in grafts were markedly increased in corneal graft group at day 11 after PKP (P < 0.05). ③The IFN-γlevels in serum were higher in the corneal graft group than in the normal control group at days 6 and 11 after PKP (P < 0.05). IFN-γlevels in serum were higher at day 11 than at days 6 and 24 after PKP (P < 0.01). IFN-γlevels in serum were lower in the dexamethasone group than in the corneal graft group at days 6 and 11 (P < 0.05). ④IFN-γand IL-4 levels in aqueous humour were higher in the corneal graft group than in the normal control group at days 6, 11 and 24 after PKP （P < 0.05）. IFN-γand IL-4 levels were lower in the dexamethasone group than in the corneal graft group at days 6 and 11 (P < 0.05-0.01). ⑤Peripheral blood CD3+CD25+/CD3+ ratio was lower in the dexamethasone group than in the corneal graft group at days 6 and 11 (P < 0.05). ⑥At day 11, the expression of CD4, CD8 and CD25 on grafts was obvious, but weak in the dexamethasone group.
CONCLUSION: IFN-γ, IL-4 and CD25 play important roles during corneal allograft rejection. Increasing the expression of IL-4 and decreasing the expression of IFN-γand CD25 may help to inhibit corneal allograft rejection. Monitoring the expression of IFN-γand CD25 in peripheral blood after surgery can help to indicate the degree of local immune reaction and predict the occurrence of corneal allograft rejection.

Gong YB, Lu XH, Zhou J, Yuan W, Ke XY, Cui GH.Effects of interferon-gamma, interleukin-4 and CD25 in rat corneal allograft immunological rejection.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(5):861-867(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-5/5k-861(ps).pdf]

角膜移植术后免疫排斥反应是手术失败的最主要原因[1]。角膜移植免疫排斥反应是一个多因素参与的极其复杂的调节过程，其中T淋巴细胞的激活是移植免疫反应的中心环节和不可缺少的条件，而作为T淋巴细胞的主要膜蛋白，白细胞介素2受体α（CD25）的表达则是T细胞活化的关键环节[2]。近来研究表明辅助性T细胞因子在角膜移植免疫中起着重要作用，根据其产生的细胞因子的种类，辅助性T细胞被分类为Thl细胞和Th2细胞[3]。Thl因子和Th2因子相互作用，互相制约，Thl因子与移植排斥反应有关，而Th2因子有助于移植耐受[4]。但也有研究表明，Th2因子与移植排斥有关，应用Th2因子抑制剂可延长移植器官的存活[5-6]。本文观察γ-干扰素（Th1因子）、白细胞介素4（Th2因子）及CD25因子在角膜移植免疫排斥反应中的局部及全身表达情况，并分析其作用。

设计：随机对照动物实验。
单位：南方医科大学珠江医院眼科。
材料：实验于2006-10/2007-05在南方医科大学南方医院实验动物中心（SPF级）完成。选用Wistar大鼠24只，雌雄不限，体质量180~220 g，SPF级；SD大鼠54只，雄性，体质量180~220 g，SPF级，均由南方医科大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK（粤）2006-0015）。实验方法符合动物伦理学要求。
主要实验试剂及药物：大鼠γ-干扰素酶联免疫吸附试剂盒（Bender MedSystems 公司，最小可测大鼠γ-干扰素达到9.9 ng/L，板内板间变异系数均小于10%），白细胞介素4酶联免疫吸附试剂盒（Bender MedSystems 公司，最小可测大鼠白细胞介素4达到0.2 ng/L，板内板间变异系数均小于10%）。一抗为小鼠抗大鼠CD4，CD8单克隆抗体（Serotec公司），兔抗大鼠CD25多克隆抗体（武汉博士德公司）；二步法抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒（广州基因公司）。FITC标记的抗大鼠CD3 mAb（FITC-anti-rat-CD3 mAb）及匹配的同型对照（Biolegend公司）；PE标记的抗大鼠CD25 mAb（PE-anti-rat-CD25 mAb）及匹配的同型对照（Serotec公司）；红细胞裂解液（晶美生物公司）。TRIzol试剂（南京凯基生物），反转录-聚合酶链反应试剂盒（南京凯基生物，反转录反应体系为20 μL，聚合酶链反应体系为50 μL）。地塞米松磷酸钠注射液（5 g/L），9 g/L氯化钠注射液。
设计、实施、评估者：设计为第一、二作者，实施和评估为全部作者，均经过正规培训。
方法：
实验分组：24只Wistar大鼠为供体；将54只SD大鼠按随机数字表法分为3组，正常组6只；角膜移植组24只，其中12只用于术后观察角膜移植植片的排斥情况及存活时间；地塞米松组24只，其中12只用于术后观察角膜移植植片的排斥情况及存活时间。
大鼠同种异体角膜移植动物模型的建立：参照Williams和Coster的方法[7]，受体选择右眼手术，供体提供双眼角膜。术前15 min滴复方托吡卡胺滴眼液及10 g/L丁卡因滴眼液各3次。在手术显微镜下进行手术，植片直
径为3.5 mm，植床直径3.0 mm，以10/0尼龙线间断缝合8针，线结暴露不包埋，术中严格无菌操作。术后注入消毒空气形成前房。角膜移植组术后给予生理盐水，共用5次。地塞米松组术后给予地塞米松注射液5 g/L，100 μg /次，共用5次。分别于术后0，2，4，6，8 d给药。
临床观察：术后每天行裂隙灯显微镜检查，参照Larkin等[8]的评分标准，以术眼角膜混浊、水肿、新生血管3项指标进行评分，3项评分之和为当日排斥反应指数，当排斥反应指数≥5或植片混浊1项达到3时，即认为免疫排斥反应发生，记录角膜排斥发生的时间。由于手术等因素造成感染、前房出血、前房消失或术后5 d内发生严重的角膜植片水肿、混浊及破坏，不能归于移植术后免疫排斥反应。并及时补充动物。
血清γ-干扰素、白细胞介素4含量改变：角膜移植组、地塞米松组分别于术后第6，11，24天各取3只，心脏采血1.5 mL。正常SD大鼠作为对照。室温下静置20 min，待自然凝固后，4 ℃离心10 min（1 000 r/min），取血清，-80 ℃储存。用酶联免疫吸附方法检测γ-干扰素、白细胞介素4含量。方法简述如下：制定标准曲线，标准品γ-干扰素含量（ng/L）为：2 000，1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.625，7.8，3.9，0；标准品白细胞介素4含量（ng/L）为：100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78，0。其余操作步骤按照说明书进行，用BIO-RAD酶标仪于450 nm处读数，根据浓度、吸光度值制定标准曲线，根据标准曲线计算出样品的细胞因子含量，分析结果。
房水γ-干扰素、白细胞介素4含量改变：角膜移植组、地塞米松组分别于术后第6，11，24天各取4只眼房水。麻醉处死大鼠后，清洁结膜囊，以前房穿刺刀切开角膜缘后，用负压吸管吸取房水。正常SD大鼠作为对照。房水4 ℃离心5 min（1 000 r/min），取上清，置于无菌Eppendorf管中，-80 ℃低温冰箱保存待用。用酶联免疫吸附方法检测γ-干扰素、白细胞介素4含量。方法同上。
组织病理和免疫组织化学检查：分别于术后第6，11，24天取角膜植片。麻醉处死后立即剪下完整角膜植片，并均分，将角膜组织置于体积分数为0.1的甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，行病理学检查。取第11天标本做病理检查同时做免疫组织化学检测植片CD4+，CD8+和CD25+ T细胞的表达：按二步法试剂盒说明书进行抗体标记，二氨基联苯胺显色，最后采用苏木精复染。阴性对照以PBS缓冲液取代一抗，用二氨基联苯胺显色。
植片内γ-干扰素、CD25 mRNA的表达：分别取正常角膜及移植术后第11天角膜植片，用反转录-聚合酶链反应方法检测植片中γ-干扰素、CD25 mRNA的表达。①用TRIzol提取总RNA。②根据反转录聚合酶链反应试剂盒说明进行反转录-聚合酶链反应。③聚合酶链反应扩增。γ-干扰素、CD25：94 ℃预变性3 min，94 ℃，30 s，48 ℃，30 s，72 ℃，30 s，30个循环后，72 ℃延伸5 min。G3PDH：94 ℃预变性3 min，94 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，30 s，35个循环后，72 ℃延伸5 min。④聚合酶链反应产物在10 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，利用凝胶成像分析系统观察电泳结果及图像分析，然后计算待测基因与G3PDH灰度值的比值并比较。
特异引物对（广州杰特伟生物科技有限公司合成）：
CD25：5’ TGTCTGTATGACCCACCG 3’ 453 bp
3’ CTCTATTCCACCTGCGTA 5’
γ-干扰素：5’GTCTTGGTTTTGCAGCTC 3’82 bp
3’CTTTCGGATCTTTCAGACT 5’
G3PDH：5’ TATCGGACGCCTGGTTAC 3’ 159 bp
3’GTTCCGACTCTTACCCTT 5’
流式细胞术检测外周血CD3+CD25+/CD3+：角膜移植组、地塞米松组分别于术后第6，11，24天各取3只，分别心脏采血1.0 mL，并放入EDTA抗凝管中，正常SD大鼠作为对照。检测方法简述如下：①取100 μL EDTA抗凝SD大鼠全血，加入10 μL FITC标记的抗大鼠CD3单克隆抗体及10 μL PE标记的抗大鼠CD25单克隆抗体，同时设立相应的同型对照，室温反应20 min。②加红细胞裂解液2 mL，溶血10 min；200 r/min离心 8 min，弃上清。③用含10 g/L牛血清白蛋白的PBS洗2次（200 r/min离心8 min），用0.5 mL PBS重悬细胞，上机检测。并用CellQuest软件分析结果。流式细胞术分析，以FSC为横轴，SSC为纵轴，二维图像显示细胞群分布，划出淋巴细胞密集区，再以CD3+ T设门。CellQuest软件分析CD3+CD25+ T /CD3+ T的比值。
主要观察指标：各组受体大鼠角膜移植排斥反应发生时间、血清及房水γ-干扰素、白细胞介素4含量、外周血CD3+CD25+/CD3+比值。
统计学方法：由第一作者应用SPSS 11.5 统计软件进行数据分析，结果以_x±s表示，两组间比较用t检验；3组以上均数比较应用单向方差分析（one-way ANOVA），样本均数间的多重比较采用LSD法；标准曲线行直线回归分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析 54只SD大鼠全部进入结果分析，无脱失。
2.2 裂隙灯显微镜观察结果及角膜移植排斥反应发生时间比较因前房出血、前房消失及术后植片感染导致手术失败6眼，排除在外，同时补充相应例数。角膜移植组术后前4 d植片植床对合好，角膜植片均透明，有轻度水肿，1例植床出现新生血管。术后5~8 d植片中度水肿，虹膜血管可见，植床不同程度的出现新生血管，3例植片内出现新生血管。术后9~13 d植床新生血管开始向植片生长，植片水肿、混浊加重，虹膜血管模糊。至第24天时血管继续生长，混浊加重，但角膜水肿有所减退。地塞米松组术后15~19 d植床出现新生血管，植片水肿、混浊，虹膜血管模糊。根据计分标准，角膜移植组大鼠发生角膜移植排斥反应的时间为(10.583±1.084) d，地塞米松组发生角膜移植排斥反应的时间为(16.417±1.379) d，地塞米松组明显延长了植片的存活时间(t=11.522, P=0.000)。
2.3 血清γ-干扰素、白细胞介素4含量检测结果根据γ-干扰素、白细胞介素4标准品浓度及其吸光度值，以吸光度为纵坐标，标准品浓度为横坐标，分别建立标准曲线，并求得回归方程：①γ-干扰素：Y=-0.012 1+0.001 0X (R2=0.995, F=1 821.70, P=0.000)。②白细胞介素4：Y=0.355 6+0.037 1X (R2=0.908, F=69.49, P=0.000)。各组大鼠血清γ-干扰素、白细胞介素4含量检测结果见表1。

如表1所示，角膜移植组大鼠角膜移植术后6，11 d血清γ-干扰素含量高于正常组（P < 0.05）；与移植术后6，24 d比较，术后11 dγ-干扰素含量最高（P < 0.01）；地塞米松组术后6，11 dγ-干扰素含量低于同期角膜移植组（P < 0.05）。
角膜移植组大鼠角膜移植术后6，11，24 d房水白细胞介素4含量与正常组差异无显著性意义（P > 0.05）；与移植术后6，24 d比较，术后11 d白细胞介素4含量变化不明显（P > 0.05）；地塞米松组术后6，11 d白细胞介素4含量与同期角膜移植组差异无显著性意义（P > 0.05）。
2.4 房水γ-干扰素、白细胞介素4含量检测结果房水γ-干扰素、白细胞介素4标准曲线及回归方程与血清的γ-干扰素、白细胞介素4标准曲线及回归方程相同。房水γ-干扰素、白细胞介素4含量检测结果见表2。

如表2所示，角膜移植组大鼠角膜移植术后6，11，24 d房水γ-干扰素含量高于正常组（P < 0.05）；与移植术后6，24 d比较，术后11 dγ-干扰素含量最高（P < 0.01）；地塞米松组术后6，11 dγ-干扰素含量低于同期角膜移植组（P < 0.05）。
角膜移植组大鼠角膜移植术后6，11，24 d房水白细胞介素4含量高于正常组（P < 0.05）；与移植术后6 d比较，术后11 d白细胞介素4含量虽然有所增高，但差异无显著性意义（P > 0.05）；地塞米松组术后6，11 d白细胞介素4含量低于同期角膜移植组（P < 0.01）。
2.5 苏木精-伊红染色及免疫组化检测结果正常组大鼠（图1）角膜较薄，可见上皮约有五六层，表层细胞为二三层，呈扁平样；中间2层稍厚，呈多边形；基底细胞为单层柱状形，栅状排列，基底膜与前弹力层连接紧密，不易分清。基质层胶原纤维板平行排列，角膜基质细胞均匀分布于纤维板之间；后弹力层苏木精-伊红染色呈红色，相对较前弹力层厚；内皮细胞单层, 呈扁平样。正常角膜透明无水肿、无混浊、无新生血管及淋巴细胞等炎性细胞浸润。
角膜移植组移植术后第6天时可见角膜植片局部上皮细胞空泡样变，部分不典型增生，基质内见散在淋巴细胞、单核细胞、浆细胞等炎性细胞浸润，毛细血管及小淋巴管增生，胶原纤维板层结构紊乱、水肿，内皮细胞减少。第11天（图2）时见植片上皮空泡变，淋巴细胞浸润，基质增厚，胶原纤维板层结构被破坏，大量淋巴细胞、单核巨噬细胞、浆细胞等炎性细胞浸润，大量新生血管、淋巴管存在，缝线周围可见由上皮样细胞和多核巨细胞包绕的异物性肉芽肿，后弹力层皱褶，内皮细胞基本不见。第24天时基质内纤维组织增生，淋巴细胞、单核巨噬细胞、浆细胞等炎性细胞减少，新生血管增多，水肿减轻，角膜逐步瘢痕化。

地塞米松组角膜移植术后11 d，角膜植片轻度水肿，基质未见明显增厚，少量淋巴细胞浸润，板层纤维基本排列规则，少量新生血管长入（图3）。
角膜移植术后第11天免疫组化检测，角膜移植组中，植片内CD4，CD8及CD25明显表达（图4），其中CD8强表达；地塞米松组中，植片内CD4，CD8及CD25表达明显减弱。

2.6 CD25、γ-干扰素在植片内的表达在角膜移植术后第11天时，角膜移植组大鼠CD25、γ-干扰素的聚合酶链反应产物凝胶电泳条带灰度值比值分别为0.985±0.150，0.695±0.036；地塞米松组CD25、γ-干扰素的聚合酶链反应产物凝胶电泳条带灰度值比值分别为0.537±0.224，0.335±0.059。与角膜移植组相比，地塞米松组CD25及γ-干扰素mRNA的表达减弱（t=2.875，P=0.045；t=9.061，P=0.001）。正常角膜植片CD25、γ-干扰素mRNA的表达检测不到。
2.7 流式细胞仪检测外周血CD3+CD25+ T/CD3+ T比值见表3。

如表3所示，角膜移植组大鼠角膜移植术后6，11，24 d外周血CD3+CD25+/CD3+比值高于正常组（P < 0.05）；与术后6，24 d比较，术后11 d CD3+CD25+/CD3+比值最高（P < 0.05）；地塞米松组术后6，11 d外周血CD3+CD25+/CD3+比值低于同期角膜移植组（P < 0.05）。见图5。

3.1 T细胞与角膜移植免疫排斥反应角膜移植免疫排斥反应是一个复杂的、多因素参与的免疫反应过程其具体发生机制目前尚不清楚。本实验中大鼠同种异体角膜移植植片病理组织学检查显示，排斥反应发生时，对照组植片内大量淋巴细胞、单核巨噬细胞、浆细胞等炎性细胞浸润，说明角膜移植免疫排斥反应的发生与细胞免疫和体液免疫都有关。但众多的研究显示，同种异体角膜移植术后的排斥反应是以T淋巴细胞介导为主的迟发性超敏反应[9-10]。
本实验中作者发现排斥反应发生时，对照组植片内CD4+，CD8+，CD25+ T细胞表达明显，尤其CD8+T细胞呈强表达。CD4和CD8是成熟T细胞中的两大亚群，对机体的免疫应答具有重要的免疫调节作用。CD25是免疫系统活化的激动因子，CD25的表达是T细胞活化的关键环节[2]。CD8+ T细胞在Th1和抗原提呈细胞的辅助下分化成具有杀伤效应的细胞毒性T淋巴细胞，细胞毒性T淋巴细胞主要通过释放穿孔素和颗粒酶来杀伤靶细胞。穿孔素和颗粒酶的表达随角膜移植免疫排斥反应程度的加强而增强，可较好的反映移植排斥反应的程度[11]。由于CD8+ T细胞在排斥反应的植片内强表达，在角膜移植免疫排斥反应的过程中究竟是CD4+ T细胞还是CD8+ T细胞发挥重要作用？史伟云等[12]认为CD4+ T细胞在角膜移植术后免疫排斥反应中起关键作用，而CD8+ T细胞可能与CD4+ T细胞有协同和加强免疫排斥的作用。
3.2 γ-干扰素/白细胞介素4与角膜移植免疫排斥反应 γ-干扰素是Thl细胞分泌的主要因子，它的作用主要是激活巨噬细胞，促进MHC分子表达和抗原提呈，抑制Th2细胞。作者用反转录-聚合酶链反应的方法检测了大鼠角膜移植术后11 d时角膜植片γ-干扰素mRNA的表达，发现术后11 d对照组植片内高表达γ-干扰素mRNA，而正常角膜则无表达，地塞米松治疗组植片内γ-干扰素表达明显减弱。Skurkovich等[13]将抗γ-干扰素抗体用于治疗人穿透性角膜移植术后排斥反应，患者视力及植片混浊情况得到明显改善。以上研究表明γ-干扰素的高表达具有促进同种异体角膜移植免疫排斥反应的作用。
白细胞介素4是Th2细胞分泌的主要因子。白细胞介素4能促进Th2细胞分化，帮助其介导体液免疫，抑制Thl细胞的增殖并下调Thl因子的分泌。有研究发现在大鼠同种异体脾移植中，通过向供体脾脏输注白细胞介素4质粒脂质体复合物，使白细胞介素4在脾脏中高表达，抑制了γ-干扰素的产生及Th1活性，延长了移植脾的存活时间[14]。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4通过阻断CD28协同刺激途径负性调节T细胞增殖，Zhang等[15]将细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4和白细胞介素4基因共同转导入小鼠下睑皮下明显延长了角膜移植术后角膜植片的存活时间。
角膜移植的免疫反应与前房密切相关，角膜内皮细胞是排斥反应的重要靶细胞，而房水是内皮细胞生存的局部微环境，房水中某些成分或物质的改变与角膜移植免疫排斥反应密切相关[16-17]。
本实验中作者发现，正常大鼠房水中仅存有微量的γ-干扰素及白细胞介素4。对照组角膜移植术后第6天，房水中γ-干扰素及白细胞介素4表达均明显增加，到第11天，γ-干扰素表达量达到高峰，而白细胞介素4的表达无明显变化。同时病理组织检查发现，随着γ-干扰素表达的增加，移植角膜逐渐出现炎性细胞浸润、新生血管及角膜混浊水肿等免疫排斥反应的表现。表明γ-干扰素表达增加与角膜移植免疫排斥反应进程密切相关。角膜移植除了引发局部的免疫反应外，作为全身器官移植的一部分，还诱发了全身的免疫反应。本实验发现，对照组角膜移植术后第6天血清中的γ-干扰素表达亦增加，到第11天，γ-干扰素表达量达到高峰，角膜移植术后24 d，γ-干扰素表达下降。而血清白细胞介素4的表达在排斥反应前后均无明显变化。血清中γ-干扰素的表达亦能很好的反应角膜移植免疫排斥反应的进程。相比较而言，血清白细胞介素4的表达在排斥反应前后均无明显变化，从而也从另一方面说明了由于白细胞介素4的低表达，不足以抑制γ-干扰素的产生，最终导致角膜移植免疫排斥反应的发生。
作者发现，对照组房水中γ-干扰素及白细胞介素4的表达远较血清中表达明显，在同种异体大鼠角膜移植免疫排斥反应的房水中均有表达。其中γ-干扰素随着角膜移植排斥反应的加剧而增加，其表达与角膜移植免疫反应的进程有关，而白细胞介素4仅在移植术后初期表达明显，此后无明显增加。作者认为，早期白细胞介素4的增加是机体的一种保护作用，作为Th2的主要因子，其表达增加是为了抑制Thl（γ-干扰素）因子的破坏作用，但是随着γ-干扰素表达的绝对增加，抑制了Th2因子的表达，机体免疫逐渐偏向了Thl，导致排斥反应的发生。因此作者认为Thl因子（γ-干扰素）在角膜移植免疫排斥反应中起着促进排斥反应的作用，而Th2因子（白细胞介素4）的高表达可能有助于诱导免疫耐受。
3.3 CD25与角膜移植免疫排斥反应 CD25是白细胞介素2受体的α链。白细胞介素2受体是由α，β和γ链组成的三聚体，α链单独构成低亲和力受体；β和γ链共同构成中等亲和力受体；αβγ链三聚体构成高亲和力受体。α链不能传导信号，但其与白细胞介素2结合与解离均比β链快，对形成高亲和力受体有重要意义。β/γ链二聚体为白细胞介素2信号传递所必需。静息的T细胞表面组成性表达白细胞介素2受体的β和γ链，此时的受体对白细胞介素2亲和力低。T细胞活化后，CD25快速表达，与β和γ链共同形成完整的复合物，这种完整的三聚体受体具有对白细胞介素2的高亲和力，故T细胞CD25的表达是T细胞活化和免疫反应启动的重要标志。在抗原的刺激下，活化的T细胞分泌白细胞介素2作用于自身的白细胞介素2受体，通过自分泌作用促进活化细胞的增殖，从而发生急性排异反应。白细胞介素2及白细胞介素2受体的表达是T细胞克隆性增殖的关键因素，在T细胞介导的急性同种异体排斥反应具有重要作用[2,18]。
同种异体角膜缘移植术后早期应用环孢素A滴眼液可抑制外周血T淋巴细胞CD25的表达从而抑制排斥反应发生。心脏移植后大鼠外周血淋巴细胞CD25表达显著高于移植前，且表达也与排斥反应的进程有关。作者发现，CD25在正常角膜无表达，而在同种异体大鼠角膜移植后发生排斥反应的对照组植片中明显表达。对照组角膜移植术后第6天外周血淋巴细胞中CD25表达明显增加，到第11天CD25表达量达到高峰，移植术后24 d CD25表达明显下降。外周血CD25的表达亦能很好的反映角膜移植免疫排斥反应发生的程度。CD25对于移植排斥反应的机制除使T细胞活增殖外，可能还增加MHCⅠ类和Ⅱ类分子的表达，以及通过调节细胞因子网络的表达向Thl类偏离。
上述实验的细胞因子只是参与角膜移植免疫排斥反应的一部分，有研究发现，在发生角膜移植免疫排斥反应的病例中，包括趋化因子、生长因子等多达17种因子呈明显表达。因此，对角膜移植免疫排斥反应的一些具体机制，还需要从细胞和分子水平上进一步阐明。

1 Price MO, Thompson RW, Price FW. Risk factors for various causes of failure in initial corneal grafts. Arch Ophthalmol 2003;121(8):1087-1092
2 何维. 医学免疫学[M]. 北京：人民卫生出版社, 2005:250-256
3 Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW, et al. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol 1986;136(7):2348-2357
4 Amirzargar A, Lessanpezeshki M, Fathi A, et al. TH1/TH2 cytokine analysis in Iranian renal transplant recipients. Transplant Proc 2005;37(7):2985-2987
5 Nocera A, Tagliamacco A, De Palma R, et al. Cytokine mRNA expression in chronically rejected human renal allografts. Clin Transplant 2004;18(5):564-570
6 Hsu LW, Goto S, Lin YC, et al. Prolongation of heart allograft survival of rats treated by a Th2 inhibitor. Transpl Immunol 2003;11(3-4):385-388
7 Williams KA, Coster DJ. Penetrating corneal transplantation in the inbred rat: a new model. Invest Ophthalmol Vis Sci 1985;26(1):23-30
8 Larkin DF, Calder VL, Lightman SL. Identification and characterization of cells infiltrating the graft and aqueous humour in rat corneal allograft rejection. Clin Exp Immunol 1997;107(2):381-391
9 Niederkorn JY, Mellon J. Anterior chamber-associated immune deviation promotes corneal allograft survival. Invest Ophthalmol Vis Sci 1996;37(13):2700-2707
10 Yamada J, Dana MR, Zhu SN, et al. Interleukin 1 receptor antagonist suppresses allosensitization in corneal transplantation. Arch Ophthalmol 1998;116(10):1351-1357
11 Wang YH, Sun XH, Zhou XT, et al. Zhonghua Yanke Zazhi 2006;42(1):57-59
王玉宏, 孙兴怀, 周行涛, 等. 抗树突状细胞单克隆抗体对大鼠角膜移植术后角膜植片穿孔素和颗粒酶B表达的影响[J]. 中华眼科杂志, 2006, 42(1):57-59
12 Shi WY, Xie LX. Zhonghua Yanke Zazhi 2005, 41(4):350-354
史伟云, 谢立信. CD4和CD8基因敲除鼠行穿透性角膜移植术后免疫排斥特征的研究[J]. 中华眼科杂志, 2005, 41(4):350-354
13 Skurkovich S, Kasparov A, Narbut N, et al. Treatment of corneal transplant rejection in humans with anti-interferon-gamma antibodies. Am J Ophthalmol 2002;133(6):829-830
14 Jiang H, Liu C, Xu J, et al. Gene transfer of interleukin-4 delays acute rejection of splenic allografts in rats. Transplant Proc 2004;36(5):1600-1603
15 Zhang EP, Franke J, Schroff M, et al. Ballistic CTLA4 and IL-4 gene transfer into the lower lid prolongs orthotopic corneal graft survival in mice. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2003;241(11):921-926
16 Funding M, Vorum H, Nexo E, et al. Soluble CD163 and interleukin-6 are increased in aqueous humour from patients with endothelial rejection of corneal grafts. Acta Ophthalmol Scand 2005;83(2):234-239
17 Yamagami H, Yamagami S, Inoki T, et al. The effects of proinflammatory cytokines on cytokine-chemokine gene expression profiles in the human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003;44(2):514-520
18 Mathan A, Kuruvilla S, Abraham G. Interleukin 2 receptor expression in renal biopsies and the diagnosis of acute allograft rejection. Indian J Pathol Microbiol 2006;49(1):12-16