重组人骨形态发生蛋白2缓释微球的制备与评价*☆

唐佩福，姚琦，孙华燕，黄鹏，崔赓,王继芳

课题背景：课题在于将组织工程与骨折内固定相结合，建立合理的动物实验模型，研究各种骨诱导因子、骨髓基质干细胞等对促进骨愈合和防治骨坏死的单一或协同作用，探讨组织工程向临床应用转化的新方法，开辟股骨颈骨折及其并发症系列治疗的新途径。本部分实验首先制备重组人骨形态发生蛋白2/聚乳酸一聚乙二醇共聚物载药缓释微球，对影响微球成球性的主要因素进行探讨，以制备出适合粒径的微球，并对于制备微球的理化特性进行研究。

偏倚或不足：重组人骨形态发生蛋白2/聚乳酸一聚乙二醇共聚物微球具有良好的缓释效果和生物活性，是一种较为理想的生长因子载体材料。但将其植入机体后可能出现异物反应和无菌性炎症反应，对骨形态发生蛋白的局部骨诱导作用不利，同时难以在原位进行固化。因此，在解决原位固化基础上，同时减少或中和局部酸性物质是应用中值得注意的问题。

同行评价：文章针对重组人骨形态发生蛋白2易被机体的循环系统吸收、清除的问题，制备了重组人骨形态发生蛋白2/聚乳酸一聚乙二醇共聚物缓释微球并探讨微球的载药、释药特性，以期延长蛋白的药效。这项研究将有利于提高重组人骨形态发生蛋白2的临床应用效能。

唐佩福☆，男，1964年生，黑龙江哈尔滨市人，汉族，博士，教授，主任医师，主要从事创伤骨科的研究。
Pftang301@126.
com

军队“十一五”基金资助项目(06MA259)*

摘要
目的: 针对重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)在体内半衰期短、易被稀释代谢的问题，探讨利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)制备载rhBMP-2微球的可行性和制备工艺，并观察其载药、释药特性。
方法：①采用W/O/W型复乳化-溶剂挥发技术制备rhBMP-2/PLGA缓释微球，并对微球的粒径和形态、包封率和载药量，体外释放性质进行测定。②异位成骨实验：昆明小鼠12只，在右侧大腿股内侧肌袋内植入含rhBMP-2的50 mg PLGA微球，4周后取材，观察成骨情况以初步检测微球中的蛋白质活性。
结果：①rhBMP-2/PLGA缓释微球形态良好，粒径主要集中在50~60 μm，包封率为（37.52±4.31）%，载药率为（5.12±1.32）%。②微球的释放存在突释，7 d内释放的药物量超过40%，大约90%的药物量于42 d内释放完全。③载药微球植入鼠股部肌袋4周，材料周围有明显的骨形成。
结论:制备的rhBMP-2/PLGA微球可以缓慢释放有活性的rhBMP-2，具有临床应用的可行性。
关键词: 载药微球；rhBMP-2；聚乳酸聚乙醇酸；生物材料

唐佩福，姚琦，孙华燕，黄鹏，崔赓,王继芳.重组人骨形态发生蛋白2缓释微球的制备与评价[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(6):1001-1004 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1001(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)06-01001-04

Preparation and evaluation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded microsphere

AIM:Recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) is prone to dilute and conduct metabolism, with a short half-life period in vivo. This study investigated the feasibility and the preparation of rhBMP-2 carrying poly (lactic-co-glycolide) (PLGA), and observed drug-loading and drug-releasing function.
METHODS: ①The rhBMP-2/PLGA microspheres were prepared using W/O/W solvent evaporation method. The particle size and morphology of the microspheres, the drug loading, the efficiency of encapsulation and in vitro release behaviors were detected.②PLGA microspheres containing 50 mg rhBMP-2 were implanted into medial vastus muscle pouches of right lateral thigh in 12 Kunming mice, and the ectopic bone formation and the activity of rhBMP-2 released from the microspheres were evaluated 4 weeks later by the heterotopia bone formation experiment.
RESULTS: ①The rhBMP-2/PLGA microspheres showed good morphology with the particles diameter at 50-60 μm, the envelopment ratio (37.52±4.31)%, and the ratio of drug loading (5.12±1.32)%.②Initial burst release of the microspheres occurred, the drug release exceeded 40% within 7 days, and approximately 90% of the drugs was released within 42 days.③Four weeks after the rhBMP-2/PLGA implanted into muscle pouches of mice, obvious bone formation was detectable histologically.
CONCLUSION: The rhBMP-2/PLGA microspheres can release slowly active rhBMP-2, showing a potential clinical application.

Tang PF, Yao Q, Sun HY, Huang P, Cui G, Wang JF.Preparation and evaluation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded microsphere.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(6):1001-1004(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1001(ps).pdf]

重组人骨形态发生蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2）等外源性生长因子的应用研究一直是组织修复再生和组织工程领域最活跃的课题之一。然而活性生长因子在体内的半衰期短，全身和局部应用很快被稀释代谢，达不到所期望的生物效应，因此国内外学者进行了大量生长因子缓释载体的研究[1-4]。其中聚乳酸一聚乙二醇共聚物(PLA-PEG) PLGA不但具有生物相容性好、无免疫反应等特点[5]，而且可通过调节聚乳酸和聚乙醇酸二单体的比例得到不同降解速率的载体材料，因而目前被广泛用作药物载体材料。本实验采用复乳-溶剂挥发法制备rhBMP-2/PLGA载药微球，对影响微球成球性及粒径的主要因素进行探讨，以制备出粒径适宜的缓释微球，并对所制备微球的理化特性进行研究。

设计：对比观察。
单位：解放军总医院骨科。
材料：PLGA（PLA/PGA 75/ 25，黏度=0.25，山东省医疗器械研究所），重组人骨形态发生蛋白2（军事医学科学院），PVA1244聚乙烯醇（北京化学试剂公司），rhBMP-2 ELISA检测试剂盒（武汉博士德公司），悬臂式搅拌机(德国IKA 公司)。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为第一、二作者，评估为全部作者。
技术路线：
复乳-溶剂挥发法制备rhBMP-2/PLGA载药微球[6]：rhBMP-2干粉10 mg用盐酸胍溶液溶解，取出100 μL PBS的rhBMP-2溶液，并加适量的牛血清白蛋白做保护剂，混匀，形成内水相，100 mg的PLGA溶于0.7 mL二氯甲烷中形成油相（含2.5%司盘-20）做油相，内水相加入油相中冰浴超声乳化，形成初乳，将初乳加入到10 mL外水相中（含1%PVA，0.5%吐温20），800 r/min搅拌4 h挥尽溶剂，过滤，蒸馏水洗涤，真空冻干，4~8 ℃储存。
微球的粒径及分布：取少量载药微球均匀分散在玻片上,在光学显微镜下计数不少于200个,用标尺测定每个微球大小,画粒径分布图。
微球表面形态学观察：取载药微球,以电镜扫描观察其表面形态。
微球的载药量[7]和包封率的测定：称取30 mg微球将其置于1 mol/L的NaCl溶液中，37 ℃振摇温育36 h，盐酸调节pH至中性。取上清rhBMP-2 ELISA检测，具体操作操作按试剂盒说明进行。载药率=微球中rhBMP-2含量/微球量；包封率=微球中rhBMP-2含量/投入的rhBMP-2质量。
微球的体外药物释放[8]：准确称取微球10 mg置于 5 mL的PBS缓冲液中（pH 7.4）37 ℃温育，分别在2，8，24 h，2，4，7，14，21，28 d取样1 mL，并补充相应体积的缓冲液。用ELISA法测定rhBMP-2的浓度,计算累计释药百分数。
微球异位成骨活性评价：清洁级昆明小鼠12只，体质量20~25 g，鼠龄3个月，雌雄不限，由解放军总医院实验动物中心（许可证号XYXK（军）2002-004）提供，速眠新(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，暴露右侧大腿股部肌肉，在一侧股内侧肌袋内植入含rhBMP-2的 50 mg PLGA微球作为实验组，4周后取材，常规固定，切片，苏木精-伊红染色观察成骨情况以检测rhBMP-2经微球包裹后的活性。实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。
主要观察指标：微球载药释药特性及成骨活性。

2.1 微球的粒径及分布见图1。干燥状态的载药微球粒径呈正态分布，粒径主要集中在50~60 μm。使用加权法求得平均粒径及标准差为（53.2±2.1）μm。

2.2 微球表面形态学观察扫描电镜观察可见微球形态规整均匀，近似圆形，无粘连。其扫描电镜图片见图2。
2.3 微球的载药率及包封率(n=3) 按前述方法测定该微球对rhBMP-2的包封率为(37.52±4.31)%，微球载药率为(5.12±1.32)%。
2.4 微球rhBMP-2的体外药物释放微球的释放存在突释（见图3），7 d内释放的药物量超过40%，这主要是由于微球表面的药物溶出所致，突释后进入缓慢释放期，大约90%的药物量于42 d内释放完全，该期的释放行为是高分子材料的缓慢降解和药物扩散引起的。

2.5 微球异位成骨活性评价肌袋实验切片染色示4周时肌肉内可见大量新骨形成，局部原有横纹肌结构模糊或消失(见图4)。

微球是一种以适宜高分子材料为载体，包裹或吸附药物而制成的球形或类球形微粒，其具有可注射性、可降解性，随微球的降解，其所携带的活性蛋白逐渐释放，达到缓释的目的。近年来以生物可降解聚合物PLGA作为载体材料来制备蛋白质和肤类微球的转运系统广受关注[9]。本实验采用近年来常用的复乳溶剂蒸发法制备W/O/W型PLGA微球。
3.1 关于药物缓释药物缓释作用是指药物在载体的作用下能缓慢释放，延长作用时间，减少给药剂量，减缓降解，提高药物稳定性。目前研究人员己将上述技术引入组织工程，即将基质材料负载各种生长因子或激素，向种子细胞定量、持续释放，以促进细胞生长分化和组织形成，保持并尽可能延长生长因子生物活性，促使其能真正在临床发挥作用的解决途径之一。
3.2 关于微球的制备在微球的制备过程中首先考虑的是rhBMP-2被微球包裹后仍要具有生物活性，目前BMP与PLGA常用的复合方法为吸附法和混合法，吸附法虽然避免制备过程中BMP丢失和有机溶剂对BMP活性的影响，但活性蛋白突释明显，很难达到良好的缓释效果[10]。混合法制备微球时，BMP直接混合于PLGA溶液中，使BMP在复合体中分散均匀，随着复合体的降解，BMP稳定释放，缓释时间易于控制，但制备过程中使用的有机溶剂二氯甲烷、丙酮等物质易影响BMP的生物活性[11]。为减少微球制备过程中使用的有机溶剂对BMP活性的影响，本实验在BMP溶液中加入白蛋白作为稳定剂，加稳定剂的作用机制可能是稳定剂可以饱和水相一有机相界面，阻止BMP在水-油界面暴露和蓄积，从而阻止BMP直接与有机溶剂、超声等不利条件接触[12-14]。
3.3 关于微球的药物释放在体外释药实验方面，因rhBMP-2是一种酸性蛋白质，在酸性或中性环境中才有活性，pH值过高会破坏其蛋白质的结构，因此体外释药可应用人工唾液或生理盐水作为释药递质。一般认为，微球中药物的释放有2种机制[15] : ①扩散机制:药物由进入微球的溶液溶解后经微球的孔隙扩散到递质中，微球表面药物的溶解及扩散可形成释药的突释效应。②降解机制:聚合物降解成为体内的代谢产物，使药物释放。本实验释药结果表明:rhBMP-2/PLGA微球中的BMP释放符合双相动力学释药规律，即初相为快速释药相，后相为缓释相，分析初相可能是位于微球表面:hBMP-2的解吸，而后相则是由微球缓慢降解所致。这种释药特点可以使局部形成有效浓度并维持下去，符合间充质细胞向成骨细胞转化的时间。
作为BMP的载体，PLGA通常无毒性、无致热性、无致敏性、无细胞毒性、无致畸致癌作用，具有良好的组织相容性，但将其植入机体后均不可避免地导致机体出现异物反应和无菌性炎症反应[16-17]。这些反应与聚合物降解缓慢和降解时局部酸性物质浓度过高有关，对BMP的局部骨诱导作用不利。同时难以在原位进行固化。因此，在解决原位固化基础上，同时减少或中和局部酸性物质都是值得注意的问题。
上述研究分析表明，采用复乳一溶剂蒸发技术能够制备具有合适粒径的rhBMP-2/PLGA载药微球。rhBMP-2/PLGA微球具有良好的缓释效果和生物活性，是一种较为理想的生长因子载体材料和释放系统[18-20]，为复合材料的制备奠定了基础。

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