重组骨形成蛋白2/壳聚糖-磷酸钙支架载体与经诱导骨髓间充质干细胞共培养的可行性★

谭颖，王晶，李志忠，林永新，查振刚，焦根龙，洪亮，吴波文

课题背景：已经证实在磷酸钙中加入壳聚糖可使磷酸钙骨水泥的力学强度明显提高，因此作者选择了壳聚糖-磷酸钙支架以加强力学强度，同时利用重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）的诱导成骨作用，制备rhBMP-2/壳聚糖-磷酸钙支架复合体，尝试寻找一种新型的骨组织工程材料。

应用要点：实验观察了经诱导的骨髓间充质干细胞在由重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）修饰后的壳聚糖-磷酸钙支架材料上的增殖和生长情况，发现rhBMP-2/壳聚糖-磷酸钙支架复合体具有良好的细胞相容性，且材料内部的多孔结构和孔径也能满足于细胞长入和骨的再生，可以作为成骨细胞的支架载体用于构建组织工程化骨。

相关链接：在骨组织工程研究中，为了增强成骨能力，已开始用人工复合材料进行骨诱导。目前有学者提出理想的骨移植材料应是适宜与骨形成蛋白、磷酸钙骨水泥等复合的支架材料，这些理论也已并取得了初步的成功。

谭颖★，男，1981年生，山东省潍坊市人，汉族，暨南大学附属第一医院在读硕士，主要从事脊柱外科研究。
tanying335@
yahoo.com.cn

通讯作者：王晶，副主任医师，副教授，暨南大学附属第一医院骨科，广东省广州市 510630 jnuwang-jing@163.com

摘要
目的: 观察经诱导的骨髓间充质干细胞在由重组人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2）修饰后的壳聚糖-磷酸钙支架材料上的增殖和生长情况，以及其作为成骨细胞的支架载体用于构建组织工程化骨的可行性。
方法：实验于2007-02/08在暨南大学附属第一医院中心实验室及暨南大学理工学院材料科学与工程系实验室完成。①制备壳聚糖-磷酸钙支架，再将其放入rhBMP-2溶液中浸泡30 min，真空抽吸后冷冻干燥。②测量改良后壳聚糖-磷酸钙支架的孔隙率及抗压强度，扫描电镜观察其超微结构；同时，将兔骨髓间充质干细胞接种于复合支架上，用成骨细胞诱导液培养1周，扫描电镜观察成骨细胞在支架上的生长及黏附情况。
结果：①rhBMP-2/壳聚糖-磷酸钙支架复合体的孔径超过100 μm，空隙率为87%，压缩弹性模量为20 MPa。②扫描电镜结果显示支架材料内部为多孔结构，孔内见有细胞生长，细胞表面可见分泌颗粒。
结论：经复合rhBMP-2后的壳聚糖-磷酸钙支架是合适三维立体多孔复合支架，有较好的细胞相容性，可以作为成骨细胞的支架载体，用于构建组织工程化骨。
关键词：壳聚糖-磷酸钙；重组人骨形态发生蛋白2；生物材料；组织工程化骨

谭颖，王晶，李志忠，林永新，查振刚，焦根龙，洪亮，吴波文.重组骨形成蛋白2/壳聚糖-磷酸钙支架载体与经诱导骨髓间充质干细胞共培养的可行性[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(6):1005-1008
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1005(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)06-01005-04

Feasibility of chitosan-calcium phosphate cement/recombinant human bone morphogenetic protein-2 composite scaffold co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells after induction

AIM:To observe the proliferation and growth of the induced bone marrow mesenchymal stem cells on the chitosan-calcium phosphate scaffolds, which are modified with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2), and explore the feasibility of chitosan-calcium phosphate as bone tissue engineering scaffold for chondroblasts.
METHODS: The experiment was done in the Central Laboratory of the First Affiliated Hospital, Jinan University and the Laboratory of Materials Science and Engineering, Jinan University Technology College from February to August in 2007.①The scaffold of chitosan-calcium phosphate cement was produced and taken into rhBMP-2 solution for 30 minutes, followed by vacuum aspiration and freeze-drying.②The porosity and compressive strength of chitosan-calcium phosphate scaffold were measured, and its microstructure was observed via scanning electron microscopy; at the same time, the rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were seeded onto the modified scaffold, being cultured in chondroblast culture fluid for one week, and the growth and adhesion of cells on the scaffold were observed with scanning electron microscope.
RESULTS: ①The porosity of rhBMP-2/chitosan-calcium phosphate composite scaffold was 87%, its pore diameter was over 100 μm, and modulus of elasticity was 20 MPa.②Scanning electron microscope showed that the scaffold had an interconnected pore structure. The cells appeared to infiltrate into the scaffold and the extracellular matrix components were observed.
CONCLUSION: The chitosan-calcium phosphate composite with rhBMP-2 is a three-dimensional porous scaffold, with good biocompatibility, and it is a good substrate candidate for bone tissue engineering scaffold for chondroblasts.

Tan Y, Wang J, Li ZZ, Lin YX, Zha ZG, Jiao GL, Hong L, Wu BW.Feasibility of chitosan-calcium phosphate cement/recombinant human bone morphogenetic protein-2 composite scaffold co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells after induction.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(6):1005-1008(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1005(ps).pdf]

支架材料是组织工程中的重点内容，目前单一成分支架难以满足对支架材料的各项要求，为了增强其成骨能力，近年来人们开始用人工复合材料进行骨诱导。有学者提出理想的骨移植材料应是适宜与骨形成蛋白、磷酸钙骨水泥等复合的支架材料，并取得了初步的成功。因此课题组合成了壳聚糖-磷酸钙支架，本实验探讨其作为重组骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2）载体的有效性，为骨缺损的临床修复提供理论依据。

设计：观察性实验。
单位：暨南大学附属第一医院骨科。
材料：实验于2007-02/08在暨南大学附属第一医院中心实验室及暨南大学理工学院材料科学与工程系实验室完成。
动物：3 月龄新西兰兔，雌雄不拘，体质量2.0~3.0 kg，广东省动物实验中心（机构许可证号SCXK(粤)2003-0002 ；粤监证字2007A001）提供。实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。
试剂和仪器：DMEM-LG培养基（Gibco，美国），特级胎牛血清（TBD，天津），地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸（Sigma，美国），乙二胺四乙酸（Amresco，美国），其余试剂为国产分析纯（广州化学试剂厂）。二氧化碳培养箱（Asheville 公司），倒置相差显微镜（OLYMPUS CK40），扫描电镜（PHILIPS XL-30），冷冻干燥机（VirTis），rhBMP-2（暨南大学生物工程研究所），壳聚糖溶液（脱乙酰度为93%，Mr 94 2000）及磷酸三钙粉末由暨南大学理工学院材料科学与工程学院提供。
设计、实施、评估者：设计为第二、三作者，干预实施及评估为全体作者。
技术路线：
壳聚糖-磷酸钙支架材料制备：将固相的磷酸三钙粉末及液相的壳聚糖溶液在室温下，以0.7 g∶1 mL比例置于培养皿内混合，搅拌均匀成糊状后，置于模具中制成直径3 mm×15 mm的中空圆柱状支架。
rhBMP-2/壳聚糖-磷酸钙支架复合体的制作及灭菌：用双蒸水10 mL将15 mg rhBMP-2粉末溶解，在此溶液中放入10个多孔圆柱状壳聚糖-磷酸钙支架，浸泡30 min，振荡10 min，抽真空至无冒气泡后，冷冻干燥6 h。取部分复合体样品，用锋利刀片切取复合材的纵切面，喷金（厚度约10 nm）后在扫描电镜下观察复合材料孔的形态、孔径及生长因子在壳聚糖-磷酸钙支架复合体中的分散情况。其余复合体材料，用钴60辐射灭菌后备用（剂量为2 kGy）。
抗压强度测定：将固化成形后的壳聚糖-磷酸钙骨水泥样品置于SHIMADZU AG-I 型电子万能试验机上，施加垂直压缩力，加载速度为1 mm/min，测试其抗压强度。
孔隙率检测：恒温条件下，在一个比重瓶中装入乙醇然后称重为m1，把质量为ms 的样品浸入乙醇中，脱气，务必使乙醇充盈于多孔支架的孔中，然后再加满乙醇，称重为m2；把浸满了乙醇的样品取出，然后将剩余的乙醇与比重瓶称重为m3。ρ 为测定温度下乙醇密度[1]。样品支架本身体积：Vs =（m1-m2+ms）/ ρ；样品支架孔体积：Vp = (m2- m3-ms)/ρ；样品支架孔隙率：ε=Vp(Vp+Vs)=( m2-m3-ms)/( m1-m3)。
兔骨髓间充质干细胞的分离、培养：取3月龄新西兰大白兔3只，用3%戊巴比妥钠按1 mL/kg耳缘静脉给药全麻，局部常规消毒，于髂棘穿刺点抽取骨髓约1 mL，迅速与l mL浓度为20 U/mL的肝素混匀，待用。将肝素化骨髓通过皮试针头，制备单细胞悬液。加入等体积的含体积分数为0.1的FBS的低糖DMEM培养基中混均，吸管吹打并接种于T-25培养瓶中。置于37 ℃，体积分数为0.05、饱和湿度的CO2培养箱中培养。72 h后首次全量换液，以后3 d换液1次，换液时用PBS冲洗，以去除悬浮细胞。每次换液后用倒置像差显微镜观察细胞生长情况并拍照记录。细胞生长至瓶底约90%面积时，按1∶3进行传代培养，取第2代细胞用于实验。
体外组织工程骨构建：①材料预湿：将成形材料置于6孔培养板上，浸于完全培养基中预湿1 h。②细胞准备：将第1代兔骨髓间充质干细胞用0.25%胰酶消化，制成1.0×109 L-1的细胞悬液。③细胞与材料联合培养：采用沉淀法接种细胞。将200 μL细胞悬液滴于材料上，将6孔板置于CO2培养箱中，接种3 h后，加入成骨诱导培养基（低糖DMEM培养基，含体积分数为0.1的FBS、10-8 mol/L地塞米松、l0 mmol/L β-磷酸甘油和50 mg/L抗坏血酸）并使之完全浸泡材料。每3 d换液1次，体外培养7 d后用于体内实验。培养1周后，部分细胞支架复合体制成扫描电镜标本。
主要观察指标：rhBMP-2/壳聚糖-磷酸钙支架复合材料的孔隙率及细胞在其上的生长情况。

2.1 兔骨髓间充质干细胞培养倒置显微镜观察原代72 h首次换液后, 可见部分细胞贴壁, 细胞呈圆形、椭圆形。多数细胞呈集落样生长。散在细胞多为梭形, 体积较大。3周左右, 细胞融合可达瓶底面积约90%。这时细胞成簇状或旋涡状生长, 细胞多为细短的梭形。传代24 h后, 大部分细胞贴壁, 少量悬浮细胞在换液时去除。5~7 d, 细胞融合可达瓶底面积约90% , 细胞为长梭形, 形态均一，见图1。

2.2 扫描电镜观察壳聚糖-磷酸钙支架扫描电镜图片显示材料样品表面较为平整，含有微孔结构，超过100 μm，见图2。 ?

2.3 扫描电镜观察细胞与rhBMP-2/壳聚糖-磷酸钙支架复合体生长情况扫描电镜图像显示兔骨髓MSCs与rhBMP-2/壳聚糖-磷酸钙支架复合体共培养7d时细胞在多孔支架材料上生长情况。图中可见材料内部为多孔状结构，且其孔径较大。孔内可见细胞生长，细胞呈纺锤形，细胞表面有分泌颗粒。见图3。

2.4 生物力学测定结果 rhBMP-2/壳聚糖-磷酸钙支架的压缩弹性模量为20 MPa，稍高于人松质骨的弹性模量[2]。
2.5 孔隙率测定结果经测定，rhBMP-2/壳聚糖-磷酸钙支架的孔隙率为87%。

组织工程中的骨组织工程研究不仅需要取材简便、成骨能力强的种子细胞，更需要适宜的人工细胞外基质(即细胞载体)材料。理想的细胞外基质材料要求[3]: ①有良好的生物相容性。②有良好的生物降解性。③具有三维立体多孔结构。④可塑性和一定的机械强度。⑤良好的材料-细胞界面。
3.1 生长因子的选择骨形态发生蛋白家族是目前应用和研究最多的骨诱导因子，它在骨发生的过程中主要起3个作用：促进细胞的趋化、有丝分裂和细胞的分化[4]。其基因重组产品rhBMP-2是惟一获FDA批准临床应用的成骨因子，rhBMP-2与可吸收明胶海绵复合在美国已被正式批准用于临床腰椎椎体间融合并正在进行腰椎后外侧融合的三期临床试验。目前应用较多的是将 rhBMP-2和生物材料复合植入体内，其中rhBMP-2可刺激体内的骨前体细胞来诱导成骨，而生物材料可方便骨组织和血管的长入。Burkus等[5]进行了大规模、多中心、随机的临床试验结果显示rhBMP-2组具有较高的融合率而无供血区并发症，优于自体骨组。由此可见BMP和载体复合是一种较为理想的骨组织替代物。
3.2 支架材料的选择羟基磷灰石与人类骨骼中的无机盐具有十分相似的化学组成, 具有良好的组织相容性、骨传导和骨诱导性能, 是目前临床上最理想的骨植入材料之一[6]。而近年来出现的磷酸钙骨水泥，其固化后的产物为羟基磷灰石[7]。早期研制的磷酸钙骨水泥普遍存在固化时间长和力学强度不足等缺点[8-9]，使其在使用时容易被局部组织出血冲去而无法原位固化且不宜用于人体负重部位。针对上述问题，许多学者对磷酸钙骨水泥进行了改性研究。壳聚糖是一种带正电荷的碱性多糖聚合物，具有生物相容性好、可降解、无毒和抗菌等许多优点[10-13]。与许多人工合成的多聚物不同，壳聚糖分子表面带有亲水的功能基团，使其便于细胞黏附[14-15]。而且，壳聚糖还具有促进成骨和基质矿化的作用[16]，不过，壳聚糖本身质地脆弱，不宜单独作为骨填充和骨组织工程材料使用。有实验发现，在磷酸钙中加入壳聚糖可使磷酸钙骨水泥的力学强度明显提高[17-18]。正因如此，本课题组选择了壳聚糖-磷酸钙支架加强其力学强度，同时利用生物相容性好，便于细胞黏附等优点，尝试寻找一种新型的骨组织工程材料。已经有研究显示，磷酸钙骨水泥承载BMP-2后表现出良好的缓释特性及诱导成骨能力[19]。
3.3 经诱导骨髓间充质干细胞与rhBMP-2/壳聚糖-磷酸钙支架载体共培养的观察本实验结果显示，rhBMP-2/壳聚糖-磷酸钙支架的弹性模量为20 MPa，略高于松质骨（5~10 MPa）[20]。这样的力学强度可完全适用于肢体负重不是太大的部位，如上肢等处。而根据实验数据显示，支架材料的孔径大于100 μm对骨长入是有利的[20-21]。根据检测孔隙率为87%，并且电镜扫描图像显示, 支架内部为多孔结构, 且有许多孔径超过了100 μm，看出复合材料具有优良的三维立体结构。这对细胞长入、工程化组织在体内的物质交换以及骨的再生都是有利的[20]。从细胞在材料中培养的结果也证明了这一点，应为从电镜图中还可以看到, 在材料内部孔隙中有细胞的长入, 且细胞表面出现分泌颗粒, 这反映了孔隙中长入的细胞具有代谢功能。从上面的实验结果可以看出, 该支架材料对细胞具有良好的亲和性, 细胞在材料细胞在材料内可发挥功能。
材料的力学强度与其孔径是一对天然的矛盾，实验发现在力学强度增加的同时，其材料内部的孔径却太小，不适于细胞的长入[22-23]。因此，为了能满足实际需要，在增大材料的力学强度和增加孔径的尝试中，寻找一个完美的平衡点就成为骨科材料研究领域中的又一个必须重视和解决的困难。从本文结果看该支架材料在达到满意力学强度的同时，并不是以牺牲材料的内部孔径为代价的。并且细胞在材料内可发挥功能，是可以作为组织工程支架材料的。
上述结果表明，rhBMP-2/壳聚糖-磷酸钙支架复合体具有良好的细胞相容性，且材料内部的多孔结构和孔径也能满足于细胞长入和骨的再生，但若要应用于临床，还需证明能否体内成骨及所生成的骨是否具有一定的力学强度并能在局部发挥功能。

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