猪牙乳头细胞与β-磷酸三钙支架构建牙髓牙本质复合体样结构*☆

张富强，傅远飞，吴伟，翁雨来，李静，张秀丽

课题背景：组织工程构建牙是当前牙再生研究的主要方向，作为牙主体结构的牙髓牙本质复合体是研究重点之一，是组织工程成功构建牙的第一步。关于组织工程化牙髓-牙本质复合体种子细胞的研究，主要以牙间充质细胞和牙髓干细胞为主，对牙乳头细胞的研究较少，对大型哺乳动物猪的牙乳头细胞研究更少。牙乳头细胞是牙髓细胞、牙本质细胞的前体细胞，以牙乳头细胞为种子细胞成功构建组织工程化牙髓牙本质复合体具有重要意义。

应用要点：①以体外培养的猪牙乳头细胞为种子细胞，β－磷酸三钙为支架材料成功构建牙髓牙本质复合体样结构，提示牙乳头来源的间充质细胞可用于构建牙齿硬组织。②阳性对照的实验结果提示，裸鼠皮下不能为牙齿再生提供良好的微环境，动物模型及植入部位有待探索。

同行评价：应用组织工程学技术再生牙齿或牙周组织的研究是目前牙齿再生的研究热点，目前进行牙齿组织工程研究的实验应用牙源性的细胞或组织，该课题应用猪牙乳头细胞再生牙髓牙本质复合体，牙乳头细胞可以作为种子细胞构建牙髓牙本质复合体样结构，是牙髓牙本质复合体再生研究中很好的细胞来源。

上海交通大学医学院附属第九人民医院，口腔医学院口腔修复科，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海市 200011

张富强☆，男，1951年生，江苏省人，汉族，1996年上海第二医科大学毕业，博士，教授，主要从事智能化高仿生人工器官修复的研究。
fredzc@online.sh.cn

上海市重点学科（特色学科）建设项目资助（T0202）*

摘要
目的: 牙乳头细胞是牙髓细胞、牙本质细胞的前体细胞，应用组织工程方法探讨以猪牙乳头细胞为种子细胞构建牙髓牙本质复合体的可行性。
方法：实验于2004-03/2005-11在上海市口腔医学重点实验室完成。以第1代猪牙乳头细胞为种子细胞与β－磷酸三钙为支架材料复合后接种在裸鼠皮下。移植在裸鼠皮下的β－磷酸三钙支架与牙乳头细胞复合物为实验组，同期移植牙胚作为阳性对照组，同期植入的空白β－磷酸三钙支架材料作阴性对照组。每组３个样本，在同一裸鼠皮下植入。８周后取材进行组织学（苏木精－伊红染色及Goldner'三色法染色）、牙本质涎蛋白免疫组织化学及透射电镜检测。
结果：①移植物组织学切片显示在支架材料孔隙内形成了牙髓牙本质复合体样结构，由牙本质基质样物质、前期牙本质样物质及牙髓样组织组成。在牙本质样物质内部可见少量牙本质小管，牙髓样组织外层细胞较为密集且单层排列，表现出成牙本质细胞样细胞的特征。②免疫组织化学染色显示，在邻近成牙本质细胞样细胞周围的前期牙本质内牙本质涎蛋白呈阳性表达。③透射电镜结果显示，实验组局部可见牙本质小管样结构。
结论：以猪牙乳头细胞为种子细胞、β－磷酸三钙为支架材料，成功构建出牙髓牙本质复合体样结构。
关键词：磷酸三钙；牙乳头细胞；牙本质；牙髓；组织构建；生物材料

张富强，傅远飞，吴伟，翁雨来，李静，张秀丽.猪牙乳头细胞与β－磷酸三钙支架构建牙髓牙本质复合体样结构[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(6):1009-1012 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1009(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)06-01009-04

Dentin-pulp complex-like structure constructed by porcine dental papilla cells and beta-tricalcium phosphate scaffold

AIM:The dental papilla cells are the precursor of dental pulp cells and dentin cells. This study investigated the constructive possibility of constructing dentin-pulp complex by tissue engineering technology, taking porcine dental papilla cells as the seed.
METHODS: This study was performed at Shanghai Key Laboratory of Stomatology from March 2004 to November 2005. Porcine dental papilla cells at the 1st generation were seeded into β-tricalcium phosphate (β-TCP) scaffold, and then the cell-scaffold complex was transplanted subcutaneously into the nude mice. The β-TCP and dental papilla cells compound was served as the experimental group, while the cells transplanted with tooth bud or β-TCP were taken as positive or negative control group respectively. Every group contained 3 samples in the same nude mouse. Eight weeks later, the transplants were detected by the methods of histology (hematoxylin-eosin, Goldner's trichrome), immunohistochemical examinations of dentin sialoprotein and transmission electron microscopy.
RESULTS: ①The histological examination showed that there were dentin-pulp complex-like structure, consisting of dentinal matrix-like tissues, predentin-like tissues and pulp-like tissues, in the hole of β-TCP scaffold. Some dentin tubule-like structures were detectable in the dentin-like tissues. Cells localized along the pulp-like tissues were dense and polarized, which were similar to the odontoblasts.②Dentin sialoprotein expression was demonstrated in pedentin-like tissues nearby the odontoblast-like cells by immunohistochemical examination.③Some dentin tube-like structures were observed in the experimental group through transmission electron microscope scans.
CONCLUSION: Dentin-pulp complex-like structure can be successfully constructed by seeding porcine dental papilla cells into β-TCP scaffold.

Zhang FQ, Fu YF, Wu W, Weng YL, Li J, Zhang XL.Dentin-pulp complex-like structure constructed by porcine dental papilla cells and beta-tricalcium phosphate scaffold.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(6):1009-1012(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1009(ps).pdf]

牙齿再生研究是当前口腔医学领域的研究热点[1-9]，其中牙齿的组织工程化再生是研究的主要方向之一。牙髓牙本质复合体是牙齿的主体结构，是牙齿再生研究领域的研究重点[1,10-13]。本实验以培养钟状期牙胚来源的牙乳头细胞为种子细胞，以多孔β－磷酸三钙为支架材料，并将复合物植入裸鼠皮下，探讨以猪牙乳头细胞为种子细胞再生牙髓牙本质复合体的可行性，为将来进行深入研究提供实验依据。

设计：对比观察。
单位：上海市口腔医学重点实验室。
材料：实验于2004-03/2005-11在上海市口腔医学重点实验室完成。实验动物：选择1天龄长枫杂交猪3只，雌雄不限，体质量（500±100）g，由上海交通大学农学院提供（SCXK(沪)2007-0013）；4周龄Balb/c裸鼠3只，雄性，体质量20 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供（SCXK(沪)2004-0005）。种子细胞：钟状期猪牙胚来源的猪牙乳头细胞，经波形丝蛋白及角蛋白免疫组织化学染色鉴定，为间充质源性细胞，使用培养至第1代的猪牙乳头细胞用于实验，使用的细胞数量约为1×107个。支架材料：可降解的β－磷酸三钙材料（上海贝奥路生物材料有限公司），为白色多孔状结构，大小为5 mm×5 mm×20 mm，密度为1.05~1.30 g/cm3，平均孔径为500~600 μm，孔隙内的内连接径大小为（100±50）μm，孔隙率约为52%。其他试剂：羊抗人牙本质涎蛋白多克隆抗体（Santa Cruz，美国）。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第一、四作者，评估者经过正规培训。
技术路线：
牙乳头细胞培养及与支架材料的准备：取猪牙胚后分离出牙乳头组织，应用酶消化法在含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12培养液培养细胞，传代后观察细胞生长情况，取处于对数生长期的细胞用于实验。细胞消化收集计数，用37 ℃预温的不含血清DMEM/F12培养液将细胞重新混悬，调节细胞浓度成2×1010 L-1备用。取厂家消毒灭菌好的支架材料，用灭菌手术刀片切割成5 mm×5 mm×3 mm大小，用不含血清的DMEM/F12培养液浸泡并在37 ℃细胞培养箱内预温备用。
细胞接种及裸鼠皮下移植：将细胞悬液滴加至支架材料表面，使材料尽可能多地吸附细胞悬液。置37 ℃孵育2 h，然后将细胞支架复合物移植到裸鼠皮下。
实验分组：移植在裸鼠皮下的β-磷酸三钙支架与牙乳头细胞复合物为实验组，同期移植牙胚作为阳性对照组，同期植入的空白β-磷酸三钙支架材料作阴性对照组。每组3个样本，在同一裸鼠皮下各植入。
主要观察指标：主要观察3组牙本质涎蛋白的表达及牙本质小管的形成。观察移植8周后裸鼠的基本情况，常规石蜡包埋切片，行苏木精-伊红染色及Goldner'三色法染色。移植物石蜡切片脱蜡水化后应用间接法进行牙本质涎蛋白免疫组织化学染色。将剩余包埋在石蜡内的部分移植物脱蜡水化，用质量分数为0.02的戊二醛固定，透射电镜观察。

2.1 实验动物数量分析纳入3只裸鼠均进入结果分析。植入8周后取材，裸鼠健康活泼，移植区皮下组织中可见支架材料形状的结节，质地坚硬。与阴性对照组和阳性对照组相比，实验组的移植物脱钙比较困难，体积分数为0.15的甲酸需脱钙约需15 d，提示移植物钙化程度及组织的致密度较高，脱钙后切开的断面可见组织呈白色。
2.2 移植物苏木精-伊红染色结果实验组移植物苏木精-伊红染色结果可见支架材料尚未完全降解，呈颗粒状，形成明显的支架形状。在支架孔隙内，可见有相应形态的“帽状”或“环形”牙髓牙本质样结构形成，与天然牙硬组织包绕软组织的结构类似。外层的牙本质基质样物质内部均匀红染，隐约可见牙本质小管样结构，并有少量细胞陷窝；内侧可见细胞成分较多的牙髓样组织，靠近基质内侧有单层整齐排列的细胞环绕，胞核蓝染排列呈线状。牙髓样组织位于孔隙中央，可见有血管生成，见图1a。阳性对照组镜下可见牙釉质、牙本质及牙髓结构，层次分明、排列有序，见图1b。阴性对照组镜下未见明显的矿化组织形成，可见材料孔隙内有少量细胞成分及胶原纤维，见图1c。
2.3 移植物Goldner'三色法染色结果实验组移植物Goldner'三色法染色可见牙髓牙本质复合体样结构的牙本质呈暗红色，有排列紊乱的牙本质小管样结构分布其中，前期牙本质样结构呈绿色，紧邻前期牙本质的细胞有极化现象，胞核深染呈黑褐色，牙髓样疏松结缔组织内部可见稀疏排列的胶原绿染，见图2a。阳性对照组可见成熟牙本质呈红色，前期牙本质呈绿色，牙本质中有排列规则的成牙本质小管，成牙本质细胞胞核深染呈黑褐色，牙髓组织细胞胞核也呈黑褐色，较为疏松的牙髓组织间质中的胶原纤维则呈淡绿色，见图2b。阴性对照组未见矿化组织形成，可见少量细胞和胶原纤维分布在原来的材料孔隙中，见图2c。

2.4 移植物免疫组织化学染色结果牙本质涎蛋白免疫组织化学染色结果可见移植物中靠近成牙本质细胞样细胞及其分泌的基质处有阳性染色（图3），并以牙乳头组织作阳性及阴性对照。

2.5 移植物透射电镜观察结果阳性对照组透射电镜下可见排列整齐的牙本质小管，见图4a，增加放大倍数后可见小管内成牙本质细胞突起中的微丝呈网状交错编织状，小管周围胶原纤维交错纵横呈网状。实验组透射电镜下可见类牙本质样组织内的基质中有数量众多、粗细不一的胶原纤维，呈网状或束状排列；局部可见少量的牙本质小管样结构，小管内部结构不如阳性对照组清晰，见图4b。

2000年，Gronthos等[10]从人第三磨牙牙髓中分离培养了牙髓干细胞，与HA-磷酸三钙支架复合后在裸鼠皮下回植6周获得了牙髓牙本质复合体样结构。2002年，Young等[3]以猪第三磨牙牙胚细胞为种子细胞，获得了具有牙冠样结构的组织。之后，Duailibi等[4]使用体外培养过1周的大鼠牙胚细胞为种子细胞进行牙齿组织工程研究，也获得了牙齿样结构。Ohazama等[14]和Modino等[15]使用了胚胎发育早期的牙源性上皮与成体骨髓基质干细胞重组，成功构建了牙齿样组织。郭红延等[16]使用大鼠牙髓干细胞成功重建了牙髓牙本质复合体样结构。以上研究有一个共同点：目前进行牙齿组织工程研究的尝试中尚无法脱离牙源性的细胞或组织。从牙齿的发育角度进行分析，牙髓牙本质复合体均为外胚间充质来源，直接的发育前身是牙胚中的牙乳头。通过实验证实，本课题组培养的牙乳头细胞可以作为种子细胞构建牙髓牙本质复合体样结构，因此，可以推论牙乳头是牙髓牙本质复合体再生研究中很好的细胞来源。
Young等[3]在研究中将分散后的牙胚细胞直接作为种子细胞，未曾进行体外培养扩增。推测其原因可能有：一是猪第三磨牙的细胞量已经达到组织工程构建组织的最低要求，二是体外培养条件尚未明确，担心体外培养时间过长影响细胞的生物学性状。结合目前尚无明确的成牙诱导条件，本实验以体外短期培养的第1代细胞作为种子细胞，希望通过缩短体外培养时间，减少体外培养对细胞生物学性状的影响。此外，本实验采用的β－磷酸三钙是目前骨组织工程领域常用的支架材料，能为细胞组织工程构建提供良好的孔隙及微环境。本实验的组织学切片显示，支架的孔隙内为富含细胞、类似牙髓的组织，其外层为牙本质基质样物质，基质内隐约可见牙本质小管，通过透射电镜也证实了有结构相似的牙本质小管样结构的存在。靠近基质内侧有单层整齐排列的细胞环绕，胞核蓝染排列呈线状，类似于成牙本质细胞。实验进一步应用Goldner'三色法染色，镜下可见在牙本质基质样物质和成牙本质细胞样细胞之间有一层绿染的前期牙本质样结构。免疫组织化学染色表明，牙本质涎蛋白在相应的前期牙本质样组织区域有较强表达[17-23]。以上结果表明，猪牙乳头细胞在支架材料的孔隙内进一步增殖、分化，并形成了类似于牙髓牙本质复合体样的结构。
在实验中发现，同期回植的牙胚组织结构分明，层次清晰，但移植在裸鼠皮下后牙胚的发育基本停滞。说明裸鼠皮下并非是牙胚进一步发育的理想场所，也提示了裸鼠皮下的微环境并非是进行牙齿再生研究的理想生长环境。
通过以上实验结果得到以下结论：以猪牙乳头细胞为种子细胞可以成功构建牙髓牙本质复合体样结构，但牙齿再生的支架材料、微环境、检测指标等尚需深入研究。

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