微囊技术对人嗜铬细胞和小鼠黑色素瘤细胞凋亡的影响*☆

陈冀衡1，杨茂元2，毕好生2

课题背景：本课题获国家自然科学基金资助，项目名称：多聚微囊化转脑啡肽基因细胞的镇痛效应和免疫耐受研究，项目批准号：39900139。①内容：脑啡肽基因修饰细胞的制备与微囊化处理；微囊化细胞的存活情况、分泌功能、致瘤性及免疫耐受研究；微囊化细胞用于慢性疼痛的研究。②成果：细胞移植前的微囊化处理，使宿主接受移植后的免疫反应明显减轻；微囊小体对移植细胞有明显的免疫保护作用，移植细胞在宿主蛛网膜下腔的存活和效应时间明显延长；转染人前脑啡肽原基因的体细胞在Wistar大鼠具有和人嗜铬细胞等效的椎管腔镇痛效应，可以取代嗜铬细胞而成为操作性更强的镇痛用细胞；微囊包裹对细胞的分泌功能和致瘤性无显著性影响。

相关链接：对于慢性疼痛的治疗，药物镇痛和生物细胞镇痛是研究的热点，生物细胞在成瘾性和依赖性方面优于药物，但其存活时间和移植后的免疫排斥反应是需要解决的问题。转染人前脑啡肽原基因细胞的体细胞可在蛛网膜下腔长期存活并发挥镇痛效应，但转染效率如何、是否可取代嗜铬细胞而成为操作性更强的镇痛用细胞还在进一步研究中。

偏倚或不足：实验设计中未比较海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠和单纯的海藻酸钠微囊这两种微囊对人嗜铬细胞、小鼠黑色素瘤细胞（B16-F1）及对照细胞小鼠成纤维细胞(NIH3T3)细胞数量、活性的影响。

1北京大学临床肿瘤学院、北京肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所麻醉科，北京市 100036；2华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室，湖北省武汉市 430000

陈冀衡☆，女，1972年生，河北省唐县人，汉族，2004年华中科技大学同济医学院毕业，博士，主治医师，主要从事临床麻醉及疼痛机制的研究。
jihengchen426@
yahoo.com.cn

通讯作者：杨茂元，华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室，湖北省武汉市 430000

摘要
目的: 观察海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）微囊对囊内细胞的存活、生长及凋亡的影响，以验证免疫隔离APA微胶囊的生物膜性和生物活性。
方法: 实验于2004-01/05在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科实验中心完成。取人嗜铬细胞原代培养，小鼠黑色素瘤细胞和小鼠成纤维细胞传代培养，将APA微囊分别包裹上述3种细胞并进行培养；根据3种细胞微囊化与否分成6组，利用MTT比色法检测各组细胞存活和生长情况，共观察9 d，并用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。
结果: ①在实验观察的9 d内，人嗜铬细胞、小鼠黑色素瘤细胞和小鼠成纤维细胞可在微囊内以细胞团的形式生长、存活。②MTT比色法检测显示各组囊内细胞与相应组裸细胞的生长、存活情况比较差异无显著性意义（P > 0.05）。③流式细胞仪检测各组囊内细胞与相应组裸细胞的凋亡百分率比较差异亦无显著性意义（P > 0.05）。
结论: 制备的APA微囊化材料及制备方法对细胞活性、生长状况及凋亡情况无不良影响，表明包裹细胞的APA微囊有良好的生物相容性和生物活性。
关键词: MTT比色法；凋亡；微囊化；嗜铬细胞；黑色素瘤细胞；生物材料

陈冀衡，杨茂元，毕好生.微囊技术对人嗜铬细胞和小鼠黑色素瘤细胞凋亡的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(6):1017-1021 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1017(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)06-01017-05

Effect of microencapsulation technique in the apoptosis of human chromaffin cells and mouse melanoma cells

AIM:To observe the survival, growth and apoptosis of alginate-polylysine-alginate (APA) microencapsulated cells, and verify the biological membrane and activity of APA microcapsules with immunoisolation.
METHODS: The experiment was carried out in the test center, Department of Anesthesiology, Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology from January to May in 2004. Human chromaffin cells were harvested for primary culture, mouse melanoma cell and mouse fibroblast were subcultured, then three kinds of cells were encapsulated and cultured in APA microcapsules. According APA microencapsulation or not, three kinds of cells were divided into 6 groups and their survival and growth were measured for 9 days by MTT colorimetric assay. Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis.
RESULTS: ①During 9-day observation, human chromaffin cells, mouse melanoma cell and mouse fibroblast in the microcapsules were all survived and grew in the clusters.②MTT colorimetric assay showed that the differences of cell growth and survival were not significant between the microencapsulated group with APA and non-microencapsulated group with APA (P > 0.05).③Flow cytometry revealed that there was no significant difference in the rate of apoptosis between the microencapsulated group and non-microencapsulated group (P > 0.05).
CONCLUSION: APA microencapsulation technique has no harm to the activity, growth and apoptosis of cells, indicating good biological compatibility and activity of APA.

Chen JH, Yang MY, Bi HS.Effect of microencapsulation technique in the apoptosis of human chromaffin cells and mouse melanoma cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(6):1017-1021(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1017(ps).pdf]

Mosmann[1]报道四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞存活和生长,其基本原理是黄色的四甲基偶氮唑盐（商品名噻唑蓝）只能被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成蓝紫色的甲臜颗粒（Formazan），颗粒经溶解后，其浓度可用分光光度计测定出吸光度值(A值), A值的大小与活细胞数呈正相关，死细胞不能转化MTT。是一种灵敏度高、重复性好、可定量的、快速易行的检测细胞活性的好方法。细胞发生凋亡后，活化的核酸内切酶将染色质DNA切割成许多小的片断，由于细胞固定后膜通透性增加，降解的DNA被释放，使细胞内DNA含量减少，经流式细胞仪测定，DNA组方图将出现低于G1期DNA含量的亚G1峰，又称凋亡峰，此峰的大小即代表凋亡细胞的多少[2]。
用以上两种方法检测人嗜铬细胞、小鼠黑色素瘤细胞及小鼠成纤维细胞的海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）微囊化细胞数量、活性并进行凋亡分析，并与相应裸细胞比较，可了解APA微囊技术对以上几种细胞生长情况的影响。实质是研究APA微囊技术对能分泌镇痛物质的人嗜铬细胞、小鼠黑色素瘤细胞的生长状况的影响。

设计：观察对比实验。
单位：北京大学临床肿瘤学院、北京肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所麻醉科
材料：实验于2004-01/05在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科实验中心完成。MTT为美国Sigma公司产品，DMSO（二甲基亚砜）为分析纯，96孔无菌细胞培养板（Corning，USA），DG-3022酶标仪为华东电子管厂产品，紫外分光光度计为Beckman Du-65型。MTT用PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）配制成5 g/L溶液，在电磁力搅拌器上搅拌30 min,用0.22 μm的微孔滤膜除菌，分装，4 ℃避光保存。
设计、实施、评估者：实验设计为第二、三作者；实验实施为第一作者，经过北京大学临床肿瘤学院、华中科技大学同济医学院附属同济医院细胞培养的专业培训；评估为第一作者，本实验采用盲法评估。
技术路线：
嗜铬细胞的分离与培养：参照杨晓明等[3]的人嗜铬细胞培养方法：取6例脑死亡成人的双侧肾上腺行原代培养，用4 ℃ Hank's液反复冲洗肾上腺，钝性分离肾上腺皮质和髓质，取出髓质组织置入另一平皿中，尽量剪碎，全部转入到试管中，整个分离过程均在冰浴中进行。在盛有组织碎片的试管中加入2.5 g/L胰蛋白酶2.0~3.0 mL,于 37 ℃水浴箱中消化20 min后,立即加入2倍的Hank's液终止消化，并经200目铜网过滤，收集过滤液至50 mL离心管中，800 r/min离心 10 min，弃去上清液，加入含体积分数为0.2的胎牛血清，10%谷氨酰胺，青霉素100 U/mL,链霉素100 mg/L,二羟乙基哌嗪乙烷磺酸（Hepes）10 mmol/L的RPMI-1640培养液(pH 7.4)5 mL，取样进行细胞计数，调整细胞浓度至108 L-1，置 37 ℃、含体积分数为0.05的CO2培养箱中培养4~6 h后换液，以后隔天换液。
嗜铬细胞的形态学检测：每隔48 h于双相倒置显微镜下观察并记录培养的嗜铬细胞形态，连续观察4 d。取样涂片，丙酮固定后行苏木精-伊红染色。光镜下观察细胞形态。
嗜铬细胞的免疫细胞化学检测：在细胞培养第2，4，6，8天，收集细胞培养液，离心（1 000 r/min）50 min，弃去上清液，用PBS洗涤2次，制成细胞涂片，丙酮固定，自然干燥。采用链酶亲合素-生物素-过氧化物酶（SABC）法进行免疫细胞化学检测。滴加一抗（小鼠抗人），浓度稀释为1∶100，4 ℃过夜后PBS冲洗，加生物素标记的二抗（羊抗小鼠），浓度稀释为1∶100，37 ℃ 30 min。PBS冲洗，再加新鲜配制的过氧化物酶标记亲合素 30 min。PBS冲洗，3，3-二氨基苯联胺（DAB）避光显色5 min。清水洗涤后，常规脱水、透明、封固。光镜下观察酪氨酸羟化酶阳性细胞，计数阳性细胞百分率。每48 h观察培养细胞的生长情况后，更换培养液。
小鼠黑色素瘤细胞（B16-F1）及小鼠成纤维细胞(NIH3T3)的培养：两种细胞株购于武汉大学中国典型培养物保藏中心，培养液均为含体积分数为0.15的胎牛血清的RPMI-1640培养基，培养条件为37 ℃、体积分数为0.05的CO2∶体积分数为0.95空气。
MTT方法的操作过程：①接种被测裸细胞（人嗜铬细胞、小鼠黑色素瘤细胞及小鼠成纤维细胞）。用2.5 g/L胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含体积分数为0.1的胎牛血清的RPMI-1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103~104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体
积200 μL。②接种被测微囊化细胞：对培养的微囊细胞每天取样分别进行细胞活性测定和细胞计数。以MTT法进行细胞活性测定[4]，实验用96孔板，每孔50个囊，平行5孔。计数细胞时每次取150个囊放入1.5 mL透明塑料离心管中，平行3份，生理盐水洗一次，加入100 μL 0.01 mol/L NaOH溶液，待微囊膜溶解后立即加入细胞培养液中和，破囊时间不能超过1 min。离心收集细胞，胰酶消化，锥虫蓝染色，计数细胞活率和细胞总数，再推算平均每个微囊的细胞数。③培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2及饱和湿度条件下培养。④呈色：培养第3，5，7，9天时，每孔加入MTT溶液（5 g/L）20 μL，37 ℃，继续孵育4 h，终止培养小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min,使蓝紫色结晶物Formazan充分溶解。⑤比色：选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（A值），并用DMSO作空白对照。
用流式细胞仪检测细胞凋亡：人嗜铬细胞及微囊化人嗜铬细胞原代培养第3天、B16-F1细胞和NIH3T3细胞传代培养第3代微囊化，将各组细胞置于体积分数为0.92的氮气及体积分数为0.05的CO2孵箱中，6，12，24，48 h缺氧后再恢复正常条件培养4 h，造成缺氧/复氧损伤所致细胞凋亡模型[5]。然后将细胞及破囊后的细胞（破囊方法同上）经胰酶消化、离心，收集5×105细胞溶于 0.3 mL含体积分数为0.08的胎牛血清的RPMI1640培养基中，加入0.7 mL预冷的乙醇，-20 ℃下固定24 h 以上，离心，弃去乙醇，PBS洗涤1遍，加0 .2 mL RNaseA (1.0 g/L) 37 ℃孵育30 min，加0.3 mL碘化丙啶(PI,100 mg/L)染色，避光30 min，用FACS Calibur流式细胞仪检测。低于G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞。
主要观察指标：计数10 000个细胞测定各期DNA含量，计算凋亡细胞百分率。采用Cellfit软件可一次性测量细胞凋亡[6]。
统计学方法：数据以_x±s表示，组间比较采用t检验。数据分析均借助SPSS 10.0统计软件包由第一作者完成。

2.1 细胞微囊化前后的形态学观察
2.1.1 人嗜铬细胞及微囊化人嗜铬细胞的形态学观察体外培养的人嗜铬细胞细胞在向四周贴壁扩展的同时以单细胞的形式均匀分布；新制备的微囊化人嗜铬细胞每一囊内可见散在的人嗜铬细胞，多成团聚集，细胞数为400～500个，微囊直径在390～400 μm。随着培养时间的延长，至第6，7天时绝大部分细胞开始崩解、死亡，见图1。在整个培养过程中，APA微囊保持球形，外表光滑，微囊膜无变形或破损。

2.1.2 B16-F1细胞、NIH3T3细胞及微囊化B16-F1细胞、微囊化NIH3T3细胞的形态学观察贴壁培养的B16-F1细胞和NIH3T3细胞在向四周贴壁扩展。新制备的微囊化B16-F1细胞和NIH3T3细胞以单细胞的形式均匀分布于囊内空间，微囊直径在390~400 μm。随着培养时间的延长，培养至3~5 d时部分细胞开始相互聚集并分裂生长，形成大小不等的细胞团，见图2。在培养至7~9 d时，细胞团直径达到50~300 μｍ，囊化细胞继续培养则生长或融合成一大团并充满整个囊，见图3。在整个培养过程中，APA微囊保持球形，外表光滑，微囊膜无变形或破损。

2.2 MTT法检测微囊化细胞的生长特性对培养的微囊化细胞分别进行细胞计数和MTT细胞活性实验。如表1所示，人嗜铬细胞在原代培养第3~5天，细胞数目及活率逐渐增多，5 d后细胞总数增加而细胞活率逐渐减少；微囊化人嗜铬细胞的生长特性与人嗜铬细胞比较差异无显著性意义（P > 0.05）。

B16-F1细胞和NIH3T3细胞总数一直呈线性增加趋势，细胞活率则总体呈下降趋势；微囊化B16-F1细胞和微囊化NIH3T3细胞的生长性与相应细胞比较差异亦无显著性意义（P > 0.05）；细胞总数的增加和细胞活率的下降使得微囊内的活细胞数在较长时间内变化幅度相对较小；MTT实验中代表有活性细胞的A值也反映出细胞由快速生长到缓慢维持的变化过程(表2，3)，与微囊活细胞数的测定结果一致。

另外，杨晓明等[3]的研究已证实人嗜铬细胞微囊化前后第2，4，6，8天儿茶酚胺及甲-脑啡肽的水平比较差异无显著性意义 (P > 0.05)。
2.3 细胞凋亡测定结果人嗜铬细胞及微囊化人嗜铬细胞缺氧6，12，24，48 h后再恢复正常条件培养4 h，细胞凋亡的百分率见表4。人嗜铬细胞与微囊化人嗜铬细胞相应时间点细胞凋亡的百分率比较差异无显著性意义（P > 0.05）。

B16-F1细胞及微囊化B16-F1细胞缺氧6，12，24，48 h后再恢复正常条件培养4 h，细胞凋亡的百分率见表5。B16-F1及微囊化B16-F1细胞相应时间点细胞凋亡的百分率比较差异无显著性意义（P > 0.05）。

NIH3T3细胞及微囊化NIH3T3细胞缺氧6，12，24，48 h后再恢复正常条件培养4 h，细胞凋亡的百分率见表6。NIH3T3细胞及微囊化NIH3T3细胞相应时间点细胞凋亡的百分率比较差异无显著性意义（P > 0.05）。

Winnie等[7]报道的人体嗜铬细胞的同种移植，其培养时间为5~7 d。本实验将人嗜铬细胞体外培养9 d连续观察，结果显示，培养第1天，细胞由于受分离、消化等操作的打击，其存活状态处于未恢复阶段；培养第3天，细胞复原，生长良好；培养第5天，细胞开始破损，转入老化阶段。该结果显示，在本实验条件下，人嗜铬细胞的原代培养在第3天处于最佳状态，与国内傅志俭等 [8]报道培养第3天的人嗜铬细胞培养液中儿茶酚胺水平最高结果相一致，且与本实验的细胞形态学检测相吻合，故认为培养第3天的人嗜铬细胞最适合进行细胞移植。B16-F1细胞和NIH3T3细胞均为可传代培养的细胞株，培养至第3代时细胞生长情况稳定。作者对各组微囊细胞的形态进行了观察，结果显示细胞均匀地分布在APA微囊内，微囊表面光滑完整，微囊内细胞存活率> 80%，说明微囊形成过程对细胞的损害不大。
MTT法检测结果证明了囊内细胞的存活，本实验将微囊化的3种细胞与相应裸细胞比较其形态学和生长特性差异无显著性。凋亡是由遗传控制的主动细胞死亡过程，主要表现为细胞皱缩、核DNA断裂，而细胞膜相对完整，由于不伴有炎性反应，因而不影响邻近细胞。本实验选择缺氧-复氧的方法制作细胞凋亡模型[4]，利用流式细胞仪检测各时间点、各组组囊内细胞与相应组裸细胞的凋亡百分率差异无显著性。以上两方面均说明本制作微囊的材料及制备方法对细胞活性及生长状况无不良影响,表明包裹细胞的APA微囊有良好的生物膜性和生物活性。
众所周知，同种异体或跨物种组织和细胞移植的最大障碍是免疫排斥反应。以往的研究认为脑是免疫特免器官[9-10]，晚近研究逐渐否定了该理论[11-12]。为了避免免疫排斥反应，长期以来人们进行了多方面的研究，主要是移植前组织配型及移植后免疫抑制剂应用等。而微囊技术作为一种免疫隔离技术，同样可避免免疫排斥,并且对宿主无毒性反应[13]。本实验发现:采用海藻酸钠和左旋多聚赖氨酸制成的微囊膜(APA膜)，性能稳定，有一定的生物相容性和机械稳定性。以其包裹的人嗜铬细胞细胞能够在RPMI1640培养基内存活，获取营养，释放镇痛物质[3]。另有报道，体外培养的微囊化B16-F1细胞胞蛛网膜下腔移植能减轻福尔马林疼痛反应，表明其可释放镇痛物质[14]。镇痛物质的释放有赖于微囊内细胞的存活，本实验即观察APA微囊对囊内细胞的存活、生长及凋亡的影响。
免疫隔离APA微胶囊应在阻挡抗体、补体和免疫细胞进入囊内的同时，很好地满足囊内细胞的生存需要和功能维持[15-16]。本实验制作的APA微囊化细胞，可在微囊内存活、生长，形成细胞团，表明细胞生长必须的营养物质可进入囊内，细胞分泌的小分子物质也可转移到囊外，因此该APA微囊能够有效地支持囊内细胞的生长和分泌功能。以往的研究表明该微囊膜的截割相对分子质量为70 000[17],在理论上也支持该微囊即可以阻挡大分子的免疫物质进入囊内，发挥免疫隔离作用，又允许小分子营养物和细胞分泌物进出微囊，满足细胞的生长需要和分泌功能的维持。实验中还发现微囊内死亡的细胞多数并不解体，可能与微囊内小而相对稳定的空间有关。另外由于微囊膜孔径小，细胞解体后的碎片和颗粒也留在囊内不能排出[18-19]。因此，随着微囊内细胞的分裂生长，囊内细胞总数一直呈增加趋势。但由于囊内空间有限，营养物的供给也不如单层培养的细胞充分，造成细胞活率总体呈下降趋势。但这恰巧使囊内人嗜铬细胞和B16-F1活细胞数可能在一定时间内维持相对稳定，从而使儿茶酚胺和阿片肽分泌量维持相对恒定，用于治疗慢性疼痛。

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