牛磺酸对微囊化肝细胞生长的影响***☆

孙志杰1,2，郭昕1，宁小娟3，李双月1,2，吕国军1,2，于炜婷1，王为1，马小军1

课题背景：同种或异种肝细胞移植过程中发生免疫排斥反应会影响细胞移植的效果，微胶囊作为一种重要的免疫隔离工具可显著降低免疫排斥反应。但微胶囊内的高渗透压胁迫环境对动物细胞生长有一定的影响。本文旨在考察抗渗透压胁迫物质牛磺酸是否可改善微囊化肝细胞的生长，以期为微囊化生物人工肝的构建提供实验基础。

应用要点：实验观察到：①牛磺酸对非微囊化肝细胞的生长无显著影响。②1.2 mmol/L牛磺酸可以显著促进微囊化肝细胞的生长，并促进细胞的聚集。实验结果为改善微囊化动物细胞生长提供了性的途径。

同行评价：实验针对微囊化细胞的培养方法进行探索，具有一定的理论意义和潜在应用价值，也有一定的创新性。

1中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程组，辽宁省大连市 116023；2中国科学院研究生院，北京市　100039；3江西农业大学理学院，江西省南昌市 330045

孙志杰☆, 男, 1978年生，新疆维吾尔自治区博乐市人，汉族，中国科学院大连化学物理研究所在读博士，主要从事微囊化细胞培养研究。
sunzj@dicp.ac.cn

通讯作者：马小军，研究员，中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程组,辽宁省大连市 116023 maxj@dicp.ac.cn

国家“八六三”项目 (2005CB5227 02) * ，国家自然科学基金资助项目(20236040, 30472102)**

摘要
目的: 微胶囊中存在一定程度的高渗透压胁迫，可造成细胞生长代谢减慢，为改善微囊化肝细胞的生长，尝试应用抗渗透压胁迫物质牛磺酸，观察其对微囊化肝细胞生长的影响。
方法: 实验于2006-07/08在中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程实验室完成。将HepG2细胞悬液(非微囊化细胞)和微囊化HepG2分别接种于牛磺酸浓度为0，0.6，0.8和1.2 mmol/L的MEM培养液中，在37 ℃体积分数为0.05的CO2中培养。MTT法测定非微囊化和微囊化HepG2细胞的生长活性，相差显微镜观察囊内细胞生长状态。
结果：①非微囊化HepG2细胞：0.6，0.8和1.2 mmol/L的牛磺酸对其生长无影响，吸光度值比较差异无显著意义（P > 0.05）。②微囊化HepG2细胞：0.6，0.8 mmol/L牛磺酸对微囊化肝细胞的生长亦无影响（P > 0.05）；但1.2 mmol/L牛磺酸可以显著改善微囊化肝细胞的生长，其吸光度值高于0 mmol/L牛磺酸组（P < 0.05），并促进细胞的聚集。
结论：1.2 mmol/L牛磺酸可以改善微囊化肝细胞的生长并抵制微囊内的高渗透压胁迫对细胞的生长抑制作用。
关键词：微囊化；牛磺酸；渗透压胁迫；肝细胞；生长；生物材料

孙志杰，郭昕，宁小娟，李双月，吕国军，于炜婷，王为，马小军.牛磺酸对微囊化肝细胞生长的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(6):1031-1034 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1031(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)06-01031-04

AIM:Hyper-osmotic stress may occur in the microcapsules, and reduce the metabolism of cells. This study was designed to investigate the influence of taurine, as an osmolarity substance, on the growth of microencapsulated hepatocytes.
METHODS: The experiment was done in the Laboratory of Biomedical Material Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics of the Chinese Academy of Sciences between July and August in 2006. Suspended HepG2 cells (control group) and microencapsulated HepG2 cells were inoculated into MEM mediums which contained 0, 0.6, 0.8 and 1.2 mmol/L taurine and cultured at 37 ℃ in an atmosphere with 0.05 volume fraction of CO2. Growth activities of suspended HepG2 cells and microencapsulated HepG2 cells were determined by MTT methods, and the growth of microencapsulated HepG2 cells was observed under phase-contrast microscopy.
RESULTS: ①Taurine at 0.6, 0.8 and 1.2 mmol/L had insignificant effects on the growth of non-encapsulated HepG2 cells. There was no significant difference in the absorptance value (P > 0.05).②Taurine at 0.6 and 0.8 mmol/L did not alter the growth of microencapsulated cells (P > 0.05), but taurine at 1.2 mmol/L increased the growth activities and prompted cell aggregation of microencapsulated HepG2 cells. The absorbtance value was also higher compared to that in 0 mmol/L taurine treatment (P < 0.05).
CONCLUSION: Taurine at 1.2 mmol/L can significantly facilitate the growth of microencapsulated HepG2 cells and can prevent the inhibition effects of hyper-osmotic stress on cellular growth.

Sun ZJ, Guo X, Ning XJ, Li SY, Lü GJ, Yu WT, Wang W, Ma XJ.Influence of taurine on the growth of microencapsulated hepatocytes.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(6):1031-1034(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1031(ps).pdf]

自从Lim 等[1]于1980 年提出生物微胶囊概念以来，微胶囊技术在生物医学领域被广泛应用[2-3]。细胞在微胶囊内呈三维立体多细胞聚集生长,这种聚集生长具有贴壁细胞无法比拟的优点,更接近体内细胞、组织的特性[4-5]。但微囊化细胞依然存在生长速率慢、延迟期长，以及细胞团中心区域坏死等缺点[6-7]。本实验室以前的研究结果发现，微囊微环境中存在的渗透压胁迫是导致这一因素的原因之一[8]。为了抵消渗透压胁迫对细胞生长的抑制作用，改进微囊化细胞生长，本文首次应用抗渗透压胁迫物质——牛磺酸，来培养微囊化肝细胞以探讨牛磺酸对微囊化肝细胞生长的影响。

设计：观察对比动物实验。
单位：中国科学院大连化学物理研究所。
材料：实验于2006-07/08在中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程实验室完成。人肝癌细胞株HepG2 (购自上海细胞库)，海藻酸钠、胰蛋白酶、聚赖氨酸、牛磺酸购自Sigma 公司, MEM 培养液购自Hyclone公司，胎牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所,其他试剂为国产分析纯。数码图像采集系统（Olympus CX31，Japan），全自动酶标仪（Labsystems Dragon, Finland）。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施及评估为第一、二、三、四、五作者，均受过微囊制备和细胞培养方面的系统训练。第六、七、八作者对论文的撰写进行全面指导。
技术路线：
细胞培养：HepG2细胞接种于含体积分数为0.1的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL 链霉素及1 mmol/L丙酮酸钠的MEM培养液中，在37 ℃, 体积分数为0.05的CO2培养箱中培养传代。观察细胞生长状况，当细胞生长至80%融合时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化,收集细胞，准备做微囊化实验。
HepG2细胞微囊化：参照王勇等[9]制备ACA 微胶囊的方法略加改动将收集的肝细胞悬浮于15 g/L的海藻酸钠溶液中,细胞密度为2×109 L-1，利用微囊静电液滴发生器(自行研制) 滴入0.1 mol/L CaCl2溶液中,形成海藻酸钙胶珠，然后用0.5 g/L多聚赖氨酸包裹，再与1.5 g/L的海藻酸钠溶液反应，最后用55 mmol/L 柠檬酸钠溶液处理,获得微囊化的HepG2 细胞。微囊平均直径为350 μm。
牛磺酸对微囊化肝细胞和贴壁培养非微囊化肝细胞生长的影响
牛磺酸干预：①非微囊化肝细胞贴壁培养：收集细胞悬液，以1.2×108 L-1的密度接种于24孔板中，加入牛磺酸浓度为0，0.6，0.8，1.2 mmol/L的MEM培养液(含体积分数为0.1的胎牛血清) 0.2 mL。培养第1，2，3，4，5，6天测定细胞活性并在相差显微镜下观察细胞状态，拍照。各浓度每个时间点重复3次。②微囊化细胞培养：取0.2 mL的APA微囊化HepG2细胞，接种于24孔板中，加入牛磺酸浓度为0，0.6，0.8，1.2 mmol/L 的MEM培养液1.5 mL。培养第0，2，6，8，10，12天测定细胞活性并在相差显微镜下观察细胞状态，拍照。各浓度每个时间点重复3次。
细胞活性检测（MTT比色法）：①贴壁培养非微囊化肝细胞：向待测孔中加入MTT（5 g/L）20 μL，37 ℃培养12 h，镜下观察细胞是否有蓝色洁净物沉积。弃上清，加入150 μL DMSO溶解结晶。以570 nm为检测波长，630 nm为参比波长，酶标仪测定吸光度。②微囊化肝细胞：将待测的微囊化肝细胞加入到96孔培养板中，每孔加入MTT（5 g/L）100 μL, 37 ℃培养12 h，镜下观察微胶囊中细胞是否有蓝色洁净物沉积。弃上清，加入2 mLDMSO溶解结晶。以570 nm为检测波长，630 nm为参比波长，酶标仪测定吸光度。
主要观察指标：不同浓度牛磺酸对非微囊化肝细胞和微囊化肝细胞生长的影响。
统计学方法：实验数据以_x±s表示。由第一作者应用Origin7.0 软件进行方差分析检测差异显著性，以P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 牛磺酸对贴壁培养细胞生长的影响非微囊化贴壁培养肝细胞在不同浓度牛磺酸作用下的吸光度值见图1。
由图1可见与未添加组相比，0.6，0.8，1.2 mmol/L的牛磺酸并没有促进或抑制贴壁培养HepG2细胞的生长，各时间点每组之间细胞活性并无显著性差异。之前预实验结果也发现0.6，0.8，1.2 mmol/L的牛磺酸并没有影响人慢
性髓原白血病细胞K562的生长（资料未显示）。

2.2 牛磺酸对微囊化肝细胞生长的影响与对照组即0 mmol/L组相比，向微囊化肝细胞中添加0.6 mmol/L(图2a)、0.8 mmol/L(图2b)牛磺酸也不能显著改善细胞的生长，直到提高牛磺酸浓度为1.2 mmol/L (图2c)。由图2c可见添加1.2 mmol/L牛磺酸后微囊化细胞生长的活性显著高于对照组。由于前期结果证明升高牛磺酸浓度至1.8，2.4，3.0 mmol/L不但不能促进平面培养K562细胞生长，反而降低了细胞的活性，所以没有再检测高浓度牛磺酸对微囊化细胞生长的影响。由此可见达到一定剂量后牛磺酸的添加有助于改善微囊化肝细胞的生长。

图3 显示了对照组与1.2 mmol/L牛磺酸组细胞生长聚集状态的差异。

由图3可见对照组和1.2 mmol/L牛磺酸组囊内细胞在第6天开始聚集生长，但添加牛磺酸组细胞聚集的程度大于对照组，第12天时牛磺酸组细胞团继续增大，直径达到100 μm，而对照组囊内细胞数量显著低于添加牛磺酸组。

微囊化肝细胞是一种重要的生物人工肝[10-12]。研究
表明与平面培养相比，微囊内肝细胞形成了紧密连接及毛细胆管样结构、具有与体肝细胞接近的特性[13-15]。腹腔内移植微囊化肝细胞可对急性肝损伤小鼠提供代谢支持作用，显著改善急性肝损伤小鼠的存活率[16]。但也发现较平面培养其生长代谢缓慢，并且延迟期增长。本实验室已有研究证明，微胶囊中存在一定程度的高渗透压胁迫[8,17]，并显著抑制了渗透压敏感酿酒酵母细胞的生长和代谢，并且通过添加抗高渗透压胁迫物质-甘油可以改善囊内细胞的生长。与酿酒酵母细胞相比，动物细胞对于渗透压非常敏感。微囊内过高的渗透压是造成细胞生长代谢减慢，延迟期过长的原因之一。
牛磺酸，化学名称2-氨基乙磺酸，是一种化学结构简单的含硫氨基酸。它不参与蛋白质组成和代谢，而是以游离形式存在或与胆汁酸形成复合物。牛磺酸可由半胱氨酸氧化脱羧而成，是细胞内含量最丰富的自由氨基酸衍生物，具有平衡细胞渗透压、维持细胞膜稳定性、调解钙稳态和对抗氧自由基损伤、抗脂质过氧化等细胞保护作用[14,18]。高渗透压胁迫条件下，细胞自身合成的牛黄酸量非常少，不足以应对高渗透压胁迫对细胞的危害，所以外源添加牛磺酸有助于提高细胞的抗胁迫能力。Sbioda等[19]报道高渗透压胁迫条件下1 mmol/L 牛磺酸可以显著提高血管上皮细胞的活率，并提出无牛磺酸培养基中添加牛磺酸更有利于细胞的生长。
基于以上分析，为了改善微囊化肝细胞的生长，本文首次考察了牛磺酸对微囊化肝细胞（HepG2）生长和代谢的影响。结果发现向微囊化肝细胞中添加0.6，0.8 mmol/L牛磺酸不能显著改善细胞的生长，直到提高牛磺酸浓度为1.2 mmol/L后微囊化细胞生长的活性显著高于平面培养细胞。由此可见达到一定剂量后牛磺酸的添加有助于改善微囊化肝细胞的生长。
由于本实验只初步测定了抗胁迫物质-牛磺酸对微囊化肝细胞生长的影响，这并不能全面反映出牛磺酸对微囊化肝细胞功能的促进作用。因此有必要检测牛磺酸对于葡萄糖消耗、乳酸产生以及功能标志物如白蛋白产量的影响（实验正在进行中）。
本实验提示由于微囊微环境中存在渗透压胁迫和氧化胁迫，向培养基中添加特殊成分提高细胞抗胁迫能力是改善微囊化动物细胞生长的途径之一。设计微囊化细胞专用培养基时也应该考虑添加各种抗胁迫物质如牛磺酸、甜菜碱等。

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