课题背景：组织工程学及材料学的发展为软骨创伤生物学修复提供了极大可能，但软骨组织工程中种子细胞自身的缺陷使得这一技术的实际应用受到了极大限制，尤其是种子细胞复合培养或其向（类）软骨细胞定向分化过程中对外源性活性因子的依赖作用成为了相关研究的瓶颈，因而如何对各种种子细胞进行优化或改造成了人们的兴趣焦点。

创新要点：通过将胰岛素样生长因子1基因导入骨髓间充质干细胞使之自行表达所需的活性蛋白，有可能优化作为种子细胞的骨髓间充质干细胞的特性，使之更适于作为软骨组织工程的种子细胞。本实验发现胰岛素样生长因子1基因修饰后的骨髓间充质干细胞可以在一定时段内理想表达所需活性蛋白，为软骨组织工程提供了新的可供选择的种子细胞改良途径。

同行评价：实验通过构建携带功能基因胰岛素样生长因子1的真核载体并成功转染靶细胞，可以为组织工程的研究提供基因修饰的种子细胞，具有较重要的意义。实验选用了纳米载体，其安全性好，转染率高，目的基因在靶细胞有高效的表达，有较好的创新性。

1河南省正骨研究院小儿骨科研究室，河南省洛阳市 471002；2重庆医科大学儿科研究所外研室，重庆市 400014

丁幸坡☆，男，1973年生，河南省洛阳市人，汉族， 2006年重庆医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事关节软骨组织工程研究。
dingx-ingpo@163.com

摘要
目的: 构建增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced-green fluorescent protein，EGFP）标记的人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor, hIGF-1）真核表达载体，转染至兔骨髓间充质干细胞，为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞。
方法：实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成。根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物，从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1，亚克隆至pMD-T18载体，测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞，通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达。
结果：成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达。
结论：新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法，经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择。
关键词：纳米载体；人胰岛素样生长因子1；骨髓间充质干细胞；生物材料

丁幸坡，金先庆，王智勇，付艳丽. 纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(6):1035-1038
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1035(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)06-01035-04

收稿日期：2007-12-25
修回日期：2008-01-22
(07-50-12-7183/N·A)

Transfection of human insulin-like growth factor-1 gene into rabbit mesenchymal stem cells mediated by nanometer vectors and the gene expression

Abstract

AIM:To gene-modify rabbit mesenchymal stem cells by transfection of eukaryotic vectors contained truncated human insulin-like growth factor-1 gene (hIGF-1) and enhanced-green fluorescent protein (EGFP) gene to provide gene-modified seed cells for tissue-engineered articular cartilage.
METHODS: The experiment was performed at Research Institute of Pediatrics, Chongqing Medical University from March 2005 to January 2006. After the amplification of truncated hIGF-1 gene from pcDNA3.1-hIGF-1 by polymerase chain reaction (PCR) according to GeneBank, the target gene fragment was inserted to plasmid pIRES2-EGFP to obtain recombinated vectors pIRES2-EGFP-hIGF1, which was identified with PCR and enzymatic digestion. Then, the transfection of restructured vectors to rabbit mesenchymal stem cells was performed mediated by nanometer vectors (polyamidoamine dendrimers, PAMAM-D). The expression of hIGF-1 gene was determined by inspection of fluorescence, flow cytometry, and RT-PCR.
RESULTS: pIRES2-EGFP-hIGF-1 labelled with enhanced-green fluorescent protein gene was constructed successfully and high efficient expression of hIGF-1 was detected in rabbit mesenchymal stem cells.
CONCLUSION: Gene transfection through nanometer vectors, PAMAM-D, is a simple, and highly effective method for gene expression in mesenchymal stem cells. The mesenchymal stem cell transfected with plasmid pIRES2-EGFP-hIGF1 is a good choice for seed cells of tissue-engineered articular cartilage.

Ding XP, Jin XQ, Wang ZY, Fu YL. Transfection of human insulin-like growth factor-1 gene into rabbit mesenchymal stem cells mediated by nanometer vectors and the gene expression.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(6):1035-1038(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1035(ps).pdf]

0 引言

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）目前被认为是软骨组织工程的最有价值的种子细胞[1-3]，但被作为基因治疗的靶细胞则尚未引起足够重视。人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor, hIGF-1）是软骨细胞增殖、分化过程中已知的作用最强的生长因子之一。本实验通过构建含截短型hIGF-1基因和增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced-green fluror protein，EGFP)的重组真核表达质粒并用纳米载体PAMAM-D转染兔MSCs，为下一步组织工程关节软骨的构建准备基因修饰的种子细胞。

1 材料和方法

设计: 单一样本实验。
单位: 河南省正骨研究院小儿骨科研究室。
材料: 实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所（BSL-1）完成。质粒pcDNA3.1-hIGF-1（北大人类基因组实验室馈赠）；pIRES2-EGFP质粒（重庆医科大学周亚莉博士馈赠）大肠杆菌DH5a（本实验室保存）；限制性内切酶Nhe I、Xho I、Taq酶、mRNA抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、100 bp DNA Ladder、X-gal、IPTG (Takara); RT-PCR试剂盒（华舜）；DMEM/F12培养基、胎牛血清、Percoll细胞分离液（Gibico）；Polyfect 转染试剂（改良PAMAM-D）、Endofree Plasmid Maxi kit(Qiagen)；FITC标记鼠抗兔单抗CD29、CD105、CD45及同型对照小鼠IgG-FITC ；hIGF-1一抗（兔抗人，Santa Cruz），hIGF-1二抗（羊抗兔）、DAB显色试剂盒；恒温摇床、CO2恒温孵箱、电泳设备（Bio-rad）；流式细胞仪、Cell-Quest分析系统（Becton Dickinson）；倒置荧光显微镜、微量核酸定量仪（Nikon）；其他常规试剂（国产分析纯）和仪器。
设计、实施、评估者：为第一、二作者，其余作者配合参加，均接受过相关正规培训。
技术路线：
目的基因hIGF-1获得和鉴定：参考文后参考文献[4]公布的hIGF-1序列及载体pIRES2-EGFP酶切位点用Primer 5.0软件设计包括上游Nhe I和下游Xho I位点的PCR引物（5'-gccgctagcgaagatgcacaccatgtcctc , 3'-ccgctcgagctacatcctgtagttcttgtttc，划线部分为Nhe I、Xho I酶切位点），从pcDNA3.1-hIGF-1中扩增截短的目的基因hIGF-1，反应条件：94 ℃ 2 min 1个循环；94 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s 25个循环；72 ℃ 5 min 1个循环，电泳初步鉴定；将PCR产物片段亚克隆至pMD18-T载体转化DH5α感受态细菌蓝白斑法筛选阳性菌落PCR确认插入片段长度，抽提质粒DNA，Nhe I、Xho I双酶切鉴定后，送Takara公司测序。
构建重组质粒：Nhe I、Xho I分别双酶切载体pMD18-hIGF-1和pIRES2-EGFP，胶回收二者酶切产物后以T4 DNA连接酶4 ℃过夜连接、转化、扩增、鉴定,将重组质粒命名为pEGFP-IRES2-hIGF-1。
靶细胞准备：MSCs的分离培养采用通用的密度梯度离心法分离纯化。将所得兔MSCs于37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱培养，隔天换液，传至第3代，待细胞融合达70%~80%，制作单细胞悬液，流式细胞测定表面抗原CD29、CD105、CD45鉴定细胞为单一性较高的MSCs后，用于实验。
hIGF-1基因转染:将兔MSCs细胞按6×105/孔接种6孔板中，孵育至40%～80%融合开始转染。将pEGFP-IRES2-hIGF-1和pIRES2-EGFP质粒DNA均以1.0 g/L浓溶解于pH 7.0的TE中，各取2.0 μL与无抗无血清培养基混合离心后，DNA溶液中加入20 μL PolyFect转染试剂，吹打混匀5次，室温孵育10 min；加0.6 mL培养基（含抗生素和血清）到该反应体系中吹打混匀后立即转入含有1.5 mL新鲜的完全培养基的6孔板中的细胞上摇匀，培养观察基因表达情况。
指标检测：分别于感染后不同时间点观察并记录荧光表达情况；感染第4天，用胰酶消化细胞，流式细胞仪检测转染效率，并收集同期转染细胞抽提总RNA, RT-PCR检测hIGF-1分子水平的表达。
主要观察指标：① pEGFP-IRES2-hIGF-1质粒的构建及鉴定。②重组基因在MSCs中的表达。

2 结果

2.1 重组质粒的鉴定 按以上扩增条件从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中顺利扩增出约410 bp大小的清晰条带，与预期相符。pMD18-hIGF-1测序结果经Blast2.0比对与公布序列一致性99.9%（281位碱基同义突变：ggt/ggc-Gly）,见图1。

重组质粒pEGFP-IRES2-hIGF-1用Nhe I和Xho I双酶切后电泳可得到约410 bp大小清晰条带，电泳结果与预期相符,见图2，同时可用上述引物PCR扩增出约410 bp的目的条带，说明质粒重组成功。

2.2 MSCs的分离培养及鉴定 原代细胞培养至8 d时细胞融合已达70%~80%，外观呈均一的长梭型，形态均一，呈典型的涡漩状排列，立体感强，贴壁紧密,见图3。流式细胞仪检测结果显示CD29、CD105为阳性，CD45为阴性，细胞均一性在95%以上，证实所得的MSCs为高纯度的MSCs。

2.3 荧光观察及转染效率 转染细胞后17 h即可观察到零星绿色荧光出现，48 h后增强，72 h达到最强,见图4。1周后逐渐减弱，但局部单克隆细胞簇的较强的荧光表达可持续长达6周，标记基因EGFP的良好表达间接证明了目的基因在蛋白水平的较好表达。

取转染第4天的MSCs以未转染的MSCs作为荧光背景作流式细胞仪检测，显示转染率达38.54%,见图5。

2.4 目的基因表达 消化收集转染的MSCs（细胞数约5×106），按照操作说明抽提总RNA作RT-PCR,扩增得到约410 bp长度产物，电泳条带清晰,见图6，证明hIGF-1在分子水平有较高表达；转染后的MSCs细胞形态发生一定变化，呈现出三角形或多角形等各种形态，表明目的基因在MSCs胞浆中的表达未明显影响细胞的生长状态。

3 讨论

在组织工程研究中，基因修饰已成为一种可行的种子细胞改良途径[5-6]。MSCs由于具有来源、取材、分化潜能、对外源基因易感性等方面的多种优势而被认为是目前首选的种子细胞[3,7]。但MSCs在体内、外向软骨细胞分化增殖过程中需要一定的微环境和某些生长因子的作用才能更好发挥其定向分化能力[8-10]，而内源性生长因子的相对缺乏和外源性生长因子价格昂贵以及外源蛋白的免疫应激反应等限制了其功能的发挥和常规使用。故通过对MSCs进行基因修饰使之自分泌或旁分泌相关的活性蛋白，以促进其自身的生物学特性的改善，已成为一种可行的种子细胞改良途径。
IGF-1能够促进MSCs向软骨细胞谱系分化、增殖，并促进软骨细胞合成其特征性的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖、维持软骨细胞表型，是目前已知的调节软骨代谢和维持软骨内环境稳定诸多因素中最关键、作用最强的生长因子[11-12]。本实验通过高效的新型转染载体PAMAM-D将携带有EGFP标记基因的hIGF-1基因导入MSCs使其自身表达该蛋白，以图在MSCs向软骨细胞分化和稳定表型的早期，细胞自身表达、分泌活性蛋白hIGF-1来发挥对细胞的积极影响，从源头上解决MSCs内源性IGF-1相对缺乏的问题。
本实验所用的真核载体pIRES2-EGFP携带有IRES（内部核糖体进入位点）序列，通过它可以将进入多克隆位点的目的基因与报告基因EGFP基因耦联起来，使二者在转录过程中保持在同一条mRNA上，从而保证了其在细胞内同时效的进行表达[13]，从而提供了一个巧妙的标记基因的作用。同时，本载体携带的EGFP基因为经过改造的GFP基因，其表达的蛋白所激发的绿色荧光强度比普通GFP高30倍以上[14]，显微镜下检测更加灵敏。本实验将截短型外源基因hIGF-1插入pIRES2-EGFP质粒多克隆位点,构建成pEGFP IRES2- hIGF-1真核表达质粒，并用Polyfect载体成功转入兔MSCs，48 h便可以在倒置荧光显微镜下观察到高强度的绿色荧光，流式细胞仪显示转染效率达到了38%以上，RT-PCR、免疫组化等方法检测证实了目的基因在靶细胞MSCs得到了高效的表达，证明构建质粒在结构上的完整性和功能活性。
在基因转染载体方面，目前使用最多的是各种病毒类载体，但它们往往存在有各种缺陷，如可诱导免疫反应、存在致瘤或致毒风险、容量有限及制备滴度不高等[15-16]。PAMAM-D是近年商业化的一种新型非病毒类纳米材料基因转移载体，具有多种优势[17]，如：属于非生物材料而没有免疫原性、无遗传和细胞毒性、特殊树枝状结构使其具有很高的基因转染效率、可一定程度介导外源基因在宿主染色体的整合从而获得转染基因的长期稳定表达、可以保护转导基因不受机体各种因素的影响从而更加稳定的发挥作用、本身具有一定的抗感染能力等。本实验采用的Polyfect试剂是进一步改良的PAMAM-D转染试剂，在实验中上述优点充分得到了充分体现，携带目的基因IGF-1的质粒得到了高效的转染，转染率达到了38%以上，远远高于相关报道中的脂质体等的转染效率[18-20]。
本实验通过构建携带功能基因IGF-1的真核载体并成功转染靶细胞MSC，为下一步组织工程关节软骨的实验研究提供了良好的基因修饰的种子细胞。

4 参考文献

1 Tuan RS. Stemming cartilage degeneration: adult mesenchymal stem cells as a cell source for articular cartilage tissue engineering. Arthritis Rheum 2006;54(10):3075-3078
2 Leo AJ, Grande DA. Mesenchymal stem cells in tissue engineering. Cells Tissues Organs 2006;183(3):112-122
3 Chen FH, Rousche KT, Tuan RS. Technology Insight: adult stem cells in cartilage regeneration and tissue engineering. Nat Clin Pract Rheumatol 2006;2(7):373-382
4 Jansen M, van Schaik FM, Ricker AT, et al. Sequence of cDNA encoding human insulin-like growth factor I precursor. Nature 1983;306 (5943): 609-611
5 Saxer RA, Bent SJ, Brower-Toland BD, et al. Gene mediated insulin-like growth factor-I delivery to the synovium. J Orthop Res 2001;19(5): 759-767
6 Hiraide A, Yokoo N, Xin KQ, et al. Repair of articular cartilage defect by intraarticular administration of basic fibroblast growth factor gene, using adeno-associated virus vector. Hum Gene Ther 2005;16(12): 1413-1421
7 Li RZ,Zheng QC,Huabei Meitan Yixueyuan Xuebao 2005;7(3): 309-310
李任增, 郑清存, 等. 软骨组织工程种子细胞和载体材料研究进展[J]. 华北煤炭医学院学报, 2005, 7 (3): 309-10
8 Kadiyala S, Young RG, Thiede MA,et al. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. Cell Transplant 1997;6(2):125-134
9 Goomer RS. Repair of articular cartilage defects by ex-vivo gene therapy. Curr Opin Orthop 2000;11(5):378-382
10 Teng Y,HU YY,.Zhonghua Shiyan Waike Zazhi 2005, 22(2): 144-146
滕勇, 胡蕴玉, 等. 成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究[J]. 中华实验外科杂志, 2005, 22(2): 144-146
11 Starkman BG, Cravero JD, Delcarlo M, et al. IGF-I stimulation of proteoglycan synthesis by chondrocytes requires activation of the PI 3-kinase pathway but not ERK MAPK. Biochem J 2005;389(Pt 3):723-729
12 Fukumoto T, Sperling JW, Sanyal A, et al. Combined effects of insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro. Osteoarthritis Cartilage 2003;11(1):55-64
13 Pinkstaff JK, Chappell SA, Mauro VP, et al. Internal initiation of translation of five dendritically localized neuronal mRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98(5): 2770-2775
14 Heim R, Cubitt AB, Tsien RY. Improved green fluorescence. Nature 1995;373(6516):663-664
15 Madry H, Kaul G, Cucchiarini M, et al. Enhanced repair of articular cartilage defects in vivo by transplanted chondrocytes overexpressing insulin-like growth factor I (IGF-I). Gene Ther 2005;12(15):1171-1179
16 Li XC,Lv G,Jin MX,et al.Zhonghua Shiyan Waike Zazhi 2004; 21 (7): 880
李小川,吕刚, 金明熙,等. 胰岛素样生长因子1抑制人椎间盘细胞凋亡及促进基质代谢的研究[J]. 中华实验外科杂志, 2004, 21 (7): 880
17 Liu XQ,Huang HZ,Zhang B,et al.Zhongguo Kouqiang Hemian Waike Zazhi 2005;3(1): 51-55
刘习强, 黄洪章, 张彬,等. PAMAM-D介导EGFP基因转染人舌鳞癌细胞的实验研究[J]. 中国口腔颌面外科杂志,2005,3(1): 51-55
18 Wang XJ,Cui LQ,Li J,et al.Shandong Yiyao 2007; 47 (2): 23-26
王晓军, 崔连群, 李季 , 等. 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和外源基因的导入[J]. 山东医药，2007, 47 (2): 23-26
19 Pan HT,Zheng QX,Guo XD,et al.Guoji Shengwu Yixue Zazhi 2006; 29(3): 129-131
潘海涛,郑启新,郭晓东,等.含RGD肽基因导入系统介导绿色荧光蛋白基因转染骨髓基质干细胞的瞬时表达检测[J]. 国际生物医学工程杂志，2006, 29(3): 129-131
20 Zou HB,An H,Jiang DB,et al.Chongqing Yije Daxue Xuebao 2004;29(4):455-458
邹海波, 安洪, 蒋电明, 等. 携带IRES的BMP_2绿色荧光蛋白表达载体的构建和表达[J].重庆医科大学学报, 2004, 29(4):455-458