课题背景：迄今为止脂质体鬼臼毒素新型制剂的基础和临床研究国内外较少报道。课题由2003年广东省科技计划项目基金资助，2004年获全军医疗成果二等奖，2005年获广州市科技进步一等奖和南方医科大学南方医院医疗成果一等奖，2006年获广东省科技进步二等奖。课题研究成果目前已达到国内外先进水平，并为临床的应用提供了重要的参考价值。

应用要点：①采用毒性低、生物相容性好的固体和液态脂质材料为载体，将药物吸附或包裹于其中，制备鬼臼毒素-纳米脂质载体。②采用改良的乳化蒸发-低温固化法制备鬼臼毒素-纳米脂质载体是简便易行的方法。③鬼臼毒素-纳米脂质载体在室温下保存具有较高的稳定性。

同行评价：实验针对目前固体脂质纳米粒存在的不足之处，如有限的载药能力、储存过程中药物泄漏现象、纳米脂质体分散液的高水分含量等，实验探索了一种脂质纳米粒的制备方法。该方法具有载药能力高、稳定性强、缓释控释效果好等优点。并在此基础上，选择对尖锐湿疣疗效确切的鬼臼毒素作为主药，以脂质纳米粒作为载药材料，采用乳化蒸发-低温固化法制备了鬼臼毒素-脂质纳米粒，考察了载体的各项性能指标。研究结果对脂质纳米粒的应用提供了基础实验数据。

南方医科大学南方医院，1皮肤科，2药学部，广东省广州市 510515

江中洪★，男，1977年生，广东省梅州市人，汉族，南方医科大学在读硕士，医师，主要从事皮肤性传播疾病的研究。
zillion@126.com

通讯作者：曾 抗，主任医师，博士生导师，南方医科大学南方医院皮肤科，广东省广州市 510515 npfk@fimmu.com

广东省科技计划项目 (2007B031 003006)*_

摘要
目的: 纳米脂质载体是近年来继固体脂质纳米粒发展起来的第2代亚微粒载药系统，具有较高的载药量和物理稳定性。探讨鬼臼毒素-脂质纳米粒（podophyllotoxin-loaded nanostructured lipid carrier，PPT-NLC）的制备方法及理化性质。
方法：实验于2006-08/2007-10在南方医科大学药学部实验室完成。选择固体脂质硬脂酸、单硬脂酸甘油脂和液态脂质油酸，采用改良的乳化蒸发-低温固化法制备PPT-NLC，用同法制备不含油酸的PPT-固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticles，SLN)纳米粒混悬液。用透射电镜、Zeta电位仪、高效液相色谱法、pH计考察PPT-NLC理化性质，并比较SLN与NLC的包封率和稳定性。
结果：透射电镜下PPT-NLC外形呈圆形或椭圆形，平均粒径为（88.2±8.4）nm，多分散指数为0.190±0.085，Zeta电位为（-33.2±3.1）mV，包封率为86.6%。PPT-SLN分别为（75.3±16.2）nm，0.300±0.072，（-25.2±3.4）mV，包封率为76.5%。
结论：PPT-NLC制备工艺简单，分布均匀，稳定性较SLN好，包封率高。
关键词：纳米脂质载体；鬼臼毒素；固体脂质纳米载体；尖锐湿疣；生物材料

江中洪，曾抗，李国锋，谷东风，任非，史毓杰.鬼臼毒素纳米脂质载体的制备及质量考察[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(6):1039-1042 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1039(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)06-01039-04

收稿日期：2007-11-28
修回日期：2008-1-14
(07-50-11-6610/Y·Y)

Preparation and characterization of podophyllotoxin-loaded nanostructured lipid carriers

Abstract

AIM:Nanostructured lipid carriers (NLC) have been developed as the second generation nanoparticulate delivery system, and possess the advantages of higher drug loading and physical stability. This study is designed to investigate the preparation method and physicochemical properties of podophyllotoxin-loaded NLC (PPT-NLC).
METHODS: This experiment was carried out in the laboratory of Pharmacy Department, Nanfang Hospital, Southern Medical University between August 2006 and October 2007. PPT-NLC was prepared by the method of emulsion evaporation and solidification at a low temperature. Monostearin, stearic acid and oleic acid were all used as lipids. PPT-solid lipid nanoparticles (PPT-SLN) suspension without oleic acid was also prepared by means of the same method. The physicochemical properties of the PPT-NLC were investigated with transmission electronic microscope, Zeta potential analyzer, high-performance liquid chromatography and pH value, respectively. Then drug entrapment efficiency and physical stability were compared between NLC and SLN.
RESULTS: Under transmission electronic microscope, PPT-NLC appeared as round or ellipse shape. The mean particle size, polydispersity index, Zeta potential and entrapment efficiency of PPT- NLC in the nanoparticles were (88.2±8.4) nm, 0.190±0.085, (-33.2±3.1) mV and 86.6%, respectively. Likewise, these index of PPT-SLN were (75.3±16.2) nm, 0.300±0.072, (-25.2±3.4) mV and 76.5%, respectively.
CONCLUSION: The PPT-NLC has simple preparation, even distribution, good stability and high efficiency of encapsulation compared with SLN.

Jiang ZH, Zeng K, Li GF, Gu DF, Ren F, Shi YJ.Preparation and characterization of podophyllotoxin-loaded nanostructured lipid carriers.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(6):1039-1042(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1039(ps).pdf]

0 引言

固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticles，SLN)是20世纪90年代初发展起来的新一代亚微粒给药系统，是指粒径在10～1 000 nm的胶体给药系统[1]，以毒性低、生物相容性好、生物可降解的固态天然或合成的类脂为载体，将药物吸附或包裹于脂质膜中制成的新一代纳米粒给药系统，具有可以控制药物释放、避免药物的降解或泄漏以及良好的靶向性等优点[2-4]。可通过高压乳匀法进行大规模生产。SLN的出现克服了传统纳米粒载体技术相关的很多问题，比如脂质体、纳米乳的药物渗漏以及聚合体纳米粒在生产过程中存在溶剂毒物残余的问题。但是，SLN也存在一些潜在的问题：有限的载药能力、储存过程中药物泄漏现象、SLN分散液的高水分含量(70%～95%)[5-6]等。
为了克服SLN的不足，近年开发出新一代可控的纳米脂质载体技术-纳米脂质载体（nanostructured lipid carrier,NLC）[7]。与SLN不同的是，在NLC中采用混合类脂为基质材料，将物态相异的液态脂质混合到固体脂质中制备。由此制备的特殊结构的纳米粒可提高载药能力、保持储藏过程包封药物的稳定性，而且能调整SLN的释放曲线；同时由于纳米隔室被固体脂质骨架所包围，所以NLC保持了SLN缓释、控释的性质。
本实验在原有脂质体系列研究的工作基础上[8-10]，选择对尖锐湿疣疗效确切的鬼臼毒素（podophyllotoxin,PPT）作为主药，以新型药物载体NLC作为载药材料，采用乳化蒸发-低温固化法[10]制备了PPT-NLC及PPT-SLN，并对其进行质量考察。

1 材料和方法

设计：对比观察。
单位：南方医科大学南方医院皮肤科和药学部。
材料：实验于2006-08/2007-10在南方医科大学药学部实验室完成。试剂：鬼臼毒素标准品（Sigma公司P81125）；硬脂酸（上海永华精细化学品有限公司）；卵磷脂（上海太伟药业有限公司，分析纯）；Brij78（Sigma公司P4019）；单硬脂酸甘油脂（上海市昊化化工有限公司，分析纯）；二氯甲烷（汕头市光华化学品厂，分析纯）；SephadexG50（瑞典进口分装）。仪器：Waters996高效液相色谱分析仪（美国Waters公司）；Zeta-sizer3000HS型粒径分析仪（英国Malvern公司）；JB-3A型定时恒温磁力搅拌器（上海雷磁新泾仪器有限公司）；TMP-1型电子天平（德国）；Hitachi H-7500型透射电镜（日本日立公司），台式pH 1000酸度计（新加坡）。
设计、实施、评估者：设计及实施为第一、二作者，评估为全部作者，均经过专业培训。
技术路线：
PPT-NLC、PPT-SLN的制备：在制备工艺研究上进行单因素考察和正交实验设计优化处方，以外观、粒径、Zeta电位、包封率、pH值及稳定性作为样本质量考察指标，最终确定以改良的乳化蒸发-低温固化法制备PPT-NLC。具体步骤如下：精密称取50 mg卵磷脂溶于10 mL无水乙醇中，超声30 min使其充分溶解，另取处方量30 mg鬼臼毒素、60 mg硬脂酸、40 mg单硬脂酸甘油脂和0.3 ml油酸溶于10 mL二氯甲烷中，将所得乙醇溶液与二氯甲烷溶液混合构成有机相。精密称取450 mg Brij78加入50 mL双蒸水中，超声15 min使其充分溶解，构成水相。将有机相加热至（75±2）℃然后缓慢注入1 000 r/min搅拌的相同温度的恒温水相中，继续搅拌3.0~4.0h，使有机溶媒完全蒸发并使体系浓缩至约5 mL形成纳米乳。将所得的淡白色乳液快速混于另一0 ℃的5 mL冰水中，并在冰水浴超声0.5 h，即得30 mg/L PPT-NLC纳米粒混悬液。用同法制备不含油酸的PPT-SLN纳米粒混悬液。
纳米粒的外观及稳定性观察：取PPT-NLC及PPT-SLN混悬液及空白的NLC混悬液样本各6份，其中3份放置于室温，另外3份放置于4 ℃冰箱内，观察24 h，1，3，6个月外观的变化；观察4 000 r/min离心15 min混悬液是否分层或出现沉淀。
纳米粒形态观察、粒径分布、Zeta电位和pH值的测定：取PPT-NLC及PPT-SLN混悬液样本各3份，各加适量双蒸水稀释，然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，以20 g/L磷钨酸钠进行负染（即负反差法），透射电镜下观察粒径大小、形态和拍照。取PPT-NLC及PPT-SLN纳米粒混悬液样本6份，各加适量双蒸水稀释，用Zeta-sizer 3000HS型粒径分析仪测定纳米粒粒径及电位，各取半量新鲜样本分别于4 ℃冰箱、室温放置6个月后，再测粒径和Zeta电

位；用pH计测定6份PPT纳米粒混悬液样本的pH值，各取半量样本分别于4 ℃、室温放置6个月后再测pH值。
纳米粒的包封率测定：取1 mL纳米粒混悬液上样于SephadexG50凝胶柱上，以pH 7.6磷酸盐缓冲液为洗脱液，洗脱速度为1.0 mL/min，可见明显呈淡蓝色乳光的洗脱部分，即为含药的纳米粒子。收集不同体积的洗脱部分，加乙醇稀释定容至100 mL，摇匀，精密量取1 mL置于10 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，用高效液相色谱法检测其中PPT的含量。另取1 mL纳米粒混悬液直接用乙醇定容至100 mL，摇匀，精密量取1 mL置于10 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，高效液相色谱法测定其中PPT含量。色谱条件：色谱柱：ODS-C18（250 mm×4.6 mm，粒径5 μm），液相条件：V（流动相甲醇）：V（水）=60∶40，采用紫外检测器检测波长=293 nm，流速=0.8 mL/min，柱温：30 ℃，进样量20 μL[11]。高效液相色谱法测量3份纳米粒样本对PPT的包封率，取平均值，根据包封率=（WE/WT）×100%，以洗脱的纳米粒子中的PPT的含量与未过柱的纳米粒混悬液中PPT的含量相比较。
主要观察指标：PPT-NLC、PPT-SLN的外观及稳定性，透射电镜下PPT-NLC、PPT-SLN的形态，PPT-NLC、PPT-SLN的粒径分布、多分散指数、Zeta电位，包封率。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0进行数据处理，数据以_x±s表示。

2 结果

2.1 外观及稳定性 制备的PPT-NLC、PPT-SLN混悬液均为半透明、淡乳色、质地均匀及带淡蓝色乳光的胶体状分散体系。放置于4 ℃冰箱内的样本，两种混悬液6个月内均无沉淀及药物结晶析出，4 000 r/min离心15 min未发现分层现象。PPT-SLN混悬液放置于室温下的样本， 2 d后可见药物结晶析出，少许细小结晶黏附瓶底，颜色变混浊, 3~6个月部分样本出现霉菌斑，瓶底有白色粉末状药物结晶析出。而PPT-NLC混悬液放置于室温下分别于7 d，均能保持稳定的均一外观，3~6个月，仅见少许细小药物絮凝，振荡后可恢复均一外观，未见明显药物沉淀、析出和分层现象。
2.2 形态学 透射电镜下PPT-NLC呈圆形或椭圆形，分布较均匀，无明显团聚现象，见图1。
2.3 粒径分布及Zeta电位比较 经Zeta-sizer 3000HS型粒径分析仪检测粒径、多分散指数、Zeta电位，见表1。放置于4 ℃冰箱、25 ℃室温6个月后检测纳米粒的粒径和Zeta电位、pH值，见表2。PPT-SLN在室温下出现沉淀、析出，未再检测。

2.4 包封率 高效液相色谱法测得3份样本中PPT-NLC及PPT-SLN纳米粒的平均包封率为86.4%，76.5%。

3 讨论

鬼臼毒素是从鬼臼类植物中提取的一种具有特效的细胞毒性物质，通过作用于哺乳动物细胞的DNA拓扑异构酶Ⅱ，抑制细胞有丝分裂而产生细胞毒作用，抑制人类乳头瘤病毒感染细胞的有丝分裂、增殖，使尖锐湿疣病变部位的细胞变性、坏死、脱落。5 g/L PPT酊剂是世界卫生组织推荐的治疗尖锐湿疣的一线外用药[12]。由于PPT酊剂存在对皮肤刺激性较大、作用时间短、对人类乳头瘤病毒潜伏感染难以奏效、缺乏良好的皮肤靶向性和大面积使用易产生系统吸收毒性等不足而限制了其在临床的进一步应用[13]。因此PPT新制型的研究和开发已成为人们关注的热点[8-10]。
SLN作为局部给药的主要优点是可避免化学不稳定药物的降解和调节药物的释放曲线，与非肠胃或口服给药相比，局部给药可减轻系统的毒副作用。同时，由于SLN具有良好的黏附性，可在皮肤表面形成连贯的具有闭塞效应的膜[14]，闭塞效应还可增加皮肤的水合作用而减少水分的散失，随着纳米粒粒径的变小或SLN局部浓度的升高黏附性增强，从而增进皮肤的水合作用，提高药物对皮肤的渗透率。同时，SLN具有缓控释作用，在表皮、真皮形成药物储库，增加药物在皮肤组织中的滞留量，直接持久地对病变细胞起作用，降低药物的全身性吸收[15]。由于NLC与SLN结构类似，因此推测NLC也具有相同的作用机制。
由于SLN分散液为热力学不稳定体系，SLN混悬液分子可以互相碰撞聚合，通常在短时间里就有粒径的增大、粒子聚合甚至胶凝。在储藏过程中，不稳定的脂质晶型易向稳定的晶型转变，使载体容纳药物的空间减少，导致被包裹的药物被排挤到载体之外，限制了SLN载药能力[6,16-17]。PPT的溶解性较差，其在液体脂质中的溶解度比在固体脂质中大，液态脂质的加入不仅可增大其包封率，同时能延缓固态脂质由α晶型向β晶型的转化和减少药物的渗漏，使NLC具有较高的载药量。
在NLC中以固体脂质和液体脂质混合物为载体材料，根据制备方法和脂质混合物成分的不同，可形成3种不同类型的NLC。①结晶缺陷型（imperfect type）：采用不同类型的脂质作为载体，由于空间结构和脂肪酸链的长短不同，使之形成不完美的结晶体，晶体中的总晶格缺陷、距离增大，从而产生更多的空间来容纳药物，这种类型的NLC可通过少量的液态脂质与固体脂质相混合制备。②无定形态型[18]（amorphous type）：药物的泄漏是由固体脂质不断的结晶和多晶形的转化引起，因此，为避免结晶过程的产生，使用冷却过程中不产生结晶结构的特殊脂质如肉豆蔻酸酯等制备NLC时可形成这种结构。③复合态型[18]（multiple type）：类似于乳剂中的W/O/W型，即0-F-W型NLC分散液(液体脂质存于固态脂质，固态脂质分散于水)。由于许多药物在液体脂质中的溶解度高于固体脂质中的溶解度，高温乳匀法制备NLC，在高温时，固体脂质和液体脂质形成一相，并且均匀地形成O/W纳米乳滴；在冷却时，特别是在结晶的过程中，固液相分离导致两者的混合性降低，液态脂质沉淀形成油纳米室。在固体脂质骨架中含有微小的液态脂质纳米隔室，提高了载体的载药能力，而且纳米隔室被固体脂质骨架所包围，所以NLC保持了SLN缓释、控释的性质。
本实验成功制备了PPT-NLC，制备工艺简单，稳定性较SLN好，包封率高，有望成为治疗尖锐湿疣的新型局部给药制剂。但此法制备质量浓度为3 g/L PPT混悬液，体系稳定；当质量浓度增加至为5 g/L时，体系可有明显的药物结晶析出，与文后参考文献[9-10]报道5 g/L PPT纳米粒混悬液有差距，考虑载药量于脂质的选材有关，尚需进一步完善各项实验提高载药量。

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