复合成骨细胞藻酸盐凝胶的体内成骨效应**☆

龚泰芳，卢云，王栋锋，陈文，孙景东，刘小涛，谢易，何少斌

课题背景：课题获得湖北省教育厅基金项目（B200524005）和十堰市科技攻关项目（2006050D）资助，本实验只是其中的阶段性成果，证实复合成骨细胞藻酸盐凝胶具有一定的异位成骨能力。

应用要点：①本实验构建的组织工程骨具有正常骨结构,可进一步完成骨组织的改建。②可注射性藻酸钙凝胶作为一种新型组织工程载体，给成骨细胞的生长增殖及代谢创造了一个良好的微环境。

偏倚或不足：实验构建的组织工程骨成骨确切、可靠，但实验过程中尚有许多问题亟待解决，如藻酸钙凝胶在体内降解过程和成骨的关系，注射该凝胶的时间、频率，最适细胞浓度等。

郧阳医学院附属十堰市太和医院骨关节外科（骨Ⅰ），湖北省十堰市 442000

龚泰芳☆，男，1969年生，湖北省十堰市人，汉族，2005年华中科技大学同济医学院毕业，博士，副主任医师，副教授，主要从事骨关节外科，骨组织工程方面的研究。
gong-tai98@yahoo.com.cn

通讯作者：何少斌，副主任医师，郧阳医学院附属十堰市太和医院骨关节外科（骨Ⅰ），湖北省十堰市 442000

湖北省教育厅项目（B200524005）*,十堰市科技攻关项目（200605 0D）*

摘要
目的: 为使骨缺损的治疗简便可行，又要保证可靠的骨修复效果，实验将成骨细胞复合于藻酸钙水凝胶中，直接经皮注射动物体内了解其成骨情况。
方法：实验于2006-01/2007-07在十堰市太和医院生命科学研究所实验室完成。将培养的兔骨髓基质成骨细胞复合于1.5%藻酸钠溶液，再加入葡萄糖酸钙，制备成骨细胞密度为1×1010 L-1、钙离子浓度为50 mmol/L的藻酸钙水凝胶。将20只健康成年新西兰大白兔左侧背部经皮注射成骨细胞-藻酸钙水凝胶复合物(实验侧)，右侧注射单纯藻酸钙水凝胶(对照侧)。于术后4，8，12周分别行X射线检查及组织学观察成骨情况。
结果：20只健康成年新西兰大白兔均进入结果分析。X射线和组织学观察表明，实验侧成骨活跃，骨再生迅速，12周内，新生骨组织明显增多，且新生骨组织趋向成熟，X线片显示高密度影;而对照侧未见骨组织出现。
结论：复合成骨细胞的藻酸钙凝胶经皮注射植入在动物体内异位成骨可靠、确切。
关键词:骨缺损；成骨细胞；藻酸盐；钙；水凝胶；经皮注射；组织工程

龚泰芳，卢云，王栋锋，陈文，孙景东，刘小涛，谢易，何少斌.复合成骨细胞藻酸盐凝胶的体内成骨效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(6):1047-1050 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1047(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)06-01047-04

AIM:To explore a convenient and feasible therapy for bone defects, and ensure its reliable effect to repair bone defects, this study was designed to compound osteoblasts with calcium alginate hydrogel, and observe the osteogenesis ability in animals by percutaneous injection.
METHODS: The experiment was carried out in the laboratory of Life Sciences Institute of Shiyan Taihe Hospital between January 2006 and July 2007. New Zealand rabbit bone marrow stromal osteoblasts cultured in vitro were mixed with 1.5% sodium alginate and calcium gluconate, resulting in a cell density of 1×1010 L-1 and 50 mmol/L calcium alginate hydrogel. The mixture was injected into the dorsal subcutaneous tissue of twenty New Zealand white rabbits in the left side (experimental side); the calcium alginate hydrogel was injected into the right side of rabbits (control side). All specimens were examined with X-ray and histology on the 4, 8, 12 postoperative weeks.
RESULTS: Twenty New Zealand white rabbits were all involved in the result analysis. X-ray and histological observations showed that the bone formation of experimental side with rapid regeneration was fast 12 weeks after injection. X-ray photograph indicated high density of calcified image in the experimental side; while no bone formation was found in the control side.
CONCLUSION: Percutaneous injection of calcium alginate hydrogel and osteoblasts composites can result into satisfactory ectopic osteogenesis in animals.

Gong TF, Lu Y, Wang DF, Chen W, Sun JD, Liu XT, Xie Y, He SB.Osteogenesis ability of composite calcium alginate hydrogel and osteoblasts.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(6):1047-1050(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1047(ps).pdf]

骨愈合是一种特殊类型的通过再生来完成的组织修复过程，尽管现代科技发展较快，但仍有5%~10%的骨折发生延迟愈合和不愈合[1]。近10余年来，随着细胞培养技术的进步，骨组织工程学的发展，人们开始应用有机材料（如聚乳酸等）或无机材料（如多孔羟基磷灰石、煅烧骨等）作为细胞载体植入体内修复骨缺损。研究表明可注射性组织替代材料通过非侵害或微创伤方式修复组织缺损,在治疗学方面具有广泛的适用性 [2-3]。这种有载体的成骨细胞和单纯细胞悬液经皮注射[4]相比，具有更确切可靠的成骨效应和技术可行性。本实验利用藻酸钠分子遇二价阳离子通过侧向交联作用可由液态变为水凝胶态的特点，将成骨细胞复合于藻酸钙水凝胶中，直接经皮注射来了解其成骨情况。

设计：对比观察实验。
单位：郧阳医学院附属十堰市太和医院骨关节外科。
材料：实验于2006-01/2007-07在十堰市太和医院生命科学研究所实验室（省卫生厅重点实验室）完成。
健康成年新西兰兔20只，体质量2.0~3.0 kg,雌雄不限，兔龄3～5个月，由郧阳医学院实验动物中心提供（许可证号scyk（鄂）2004-0005）。
主要仪器和试剂：葡萄糖酸钙，藻酸钠干粉（Fluka公司），地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠 (Sigma,美国),淋巴细胞分离液(上海试剂二厂),碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物制品公司), DMEM培养基、胎牛血清（Gibco,美国），Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶（华美生物技术公司）,相差显微镜(Olympus,日本)。
设计、实施、评估者：设计为第一、三作者，实施为第一、二、三、四作者，评估为第一、二、七、八作者。
方法：
兔骨髓基质成骨细胞的诱导培养：3%戊巴比妥钠1 mL/kg耳缘静脉注射麻醉新西兰大白兔,无菌条件下用16号骨穿针于股骨髁上作骨髓腔穿刺,抽吸双侧股骨骨髓共4 mL,采用离心法和贴壁法相结合的办法培养，步骤如下：缓慢将骨髓组织加入到含有等量体积淋巴细胞分离液的离心管中,以2 000 r/min离心18 min,吸取中间乳白色云雾状有核细胞层,PBS液漂洗,1 500 r/min离心5 min,弃上清,加入基础培养液(含体积分数为0.10的胎牛血清,100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素),反复吹打制成单细胞悬液,细胞以3× 105个/cm2接种于培养瓶,置37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度孵箱内孵育,3 d后首次全量换液,弃去大量的悬浮细胞,以后每2.0~3.0 d根据培养液颜色换液。待细胞贴壁并长满单层后,用0.25%的胰蛋白酶消化传代,接种密度为 3×104/cm2。改用矿化诱导培养液(含体积分数为0.10的胎牛血清、地塞米松10-8 mol/L、维生素C 50 mg/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L)培养。待细胞长满全层后如上法传代。
复合成骨细胞藻酸盐水凝胶的制备与注射植入：将藻酸钠干粉配制成质量分数为1.5%，pH值为7.2的溶液，120 ℃高压消毒30 min，4 ℃保存备用。将培养的成骨细胞(图1)用0.25%胰蛋白酶制成混悬液，800 r/min离心8 min以浓集细胞，细胞计数后加入上述1.5%藻酸钠溶液，使细胞密度为1×1010 L-1，无菌条件下向该溶液注入葡萄糖酸钙，使其钙离子浓度为50 mmol/L，则藻酸钠分子在二价钙离子作用下发生侧向交联，形成了成骨细胞密度为1×1010 L-1的藻酸钙水凝胶，经旋涡振荡器混匀后4 ℃保存备用。

取20只健康成年新西兰大白兔，左侧背部皮下注射植入4 mL复合成骨细胞藻酸盐凝胶,分两个注射点，各2 mL（实验侧）;右侧同样方法单纯注射藻酸钙凝胶（对照侧）。
观察方法：①每日观察动物背部皮下结节的大小和硬度变化。②X射线片检查：分别于注射后4，8，12周拍X射线片。③组织学检查：注射后4，8周分别处死动物5只，12周处死剩下动物，取材，甲醛固定，脱钙，石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色，行组织学观察。
主要观察指标：①大体观察结果。②X射线片观察结果。③组织学观察结果。

2.1 实验动物数量分析实验动物无意外死亡，均进入结果分析。
2.2 大体观察和X射线片观察结果注射后4周,实验侧和对照侧均在动物皮下注射处形成结节,质地比藻酸钙凝胶硬。注射后8，12周,实验侧皮下结节质地似骨组织样坚硬,随时间推移结节稍变大。X射线片均显示有明显成骨现象,呈现高密度影像(图2)；对照侧结节的质地明显较实验侧软, 随时间推移结节无变化，X射线片未显示成骨影像。

2.3 组织学观察结果实验侧4周时可见炎性细胞和巨噬细胞侵润，8周时消失，这种免疫排斥反应较轻微，实验动物生长良好，对照侧未见明显炎性反应。实验侧4周时苏木精-伊红染色显示有大量软骨样组织,新骨组织形成不明显，仅可见较少散在的新生骨；实验侧8周时新骨生成活跃，呈现软骨样组织和骨样组织混合存在的现象,软骨内成骨表现明显，可见较多成骨细胞生长，且骨小梁排列趋于有序(图3) 。

实验侧12周时苏木精-伊红染色显示新生骨组织明显增多,且新生骨组织趋向成熟、致密，无明显软骨样组织（图4）。

对照侧4，8，12周标本苏木精-伊红染色均未见骨组织出现(图5)。

体外培养的成骨细胞具有较好的在体成骨能力。Diduch等[5]将体外培养的成骨细胞装入一个微孔滤膜扩散盒内，然后回植入动物体内，4周后盒内形成典型骨组织，由于这种装置的滤膜只允许小分子的营养物及代谢废物自由出入，周围组织细胞无法长入，因此，盒内骨组织只能是由盒内的成骨细胞形成的。Simmons等[6]用同样方法证实培养的颅骨成骨细胞也具有较好的在体成骨能力。国内姚振强等[7]用放射自显影技术也证实了移植于骨缺损处的兔骨膜成骨细胞2～4周即可形成骨组织。经皮直接注射细胞悬液修复骨缺损不失为一种简便可行的办法，但从细胞社会学[8]观点看，无载体的成骨细胞的生长增殖、成骨能力必然下降。在体内环境中细胞和胞外基质存在着广泛的联系，成骨活动就是一个以成骨细胞为中心的，由细胞外基质、破骨细胞及多种生长因子参入并调控的复杂的生理活动。以往的研究证实,成纤维细胞、软骨细胞和成骨细胞可在藻酸钠水凝胶中成活并形成细胞外基质[9-11],为可注射性组织工程骨研究提供了依据。为了使骨缺损的治疗简便可行，又要保证可靠的骨修复效果，本实验选用藻酸钠溶液，利用藻酸钠分子在二价阳离子作用下可发生侧向交联形成藻酸盐水凝胶的特性，实验中用二价钙离子作为交联剂，所形成的藻酸钙水凝胶具有较好的网状三维结构，成骨细胞通过此载体可获取营养并生长增殖，是理想的人工胞外基质，且为凝胶状，有适针性和可注射性；另外，有作者实验证明藻酸钙凝胶在体内可通过酶解方式逐渐降解，产物对人体无毒害作用[12]。
本实验方法构建的可注射性组织工程骨成骨可靠，且主要表现为软骨内成骨。在注射后4周和8周标本软骨样组织较多,注射后12周主要为骨组织，而且可见髓腔样结构,说明本实验构建的组织工程骨具有正常骨结构,可进一步完成骨组织的改建。这一现象与以往报道应用生物陶瓷类支架的膜内成骨具有较大差异[13],这可能与支架材料的种类等因素有关。
注射植入的方法具有较多优点：①该方法简便易行，具有非侵害或微创伤修复骨缺损或畸形的特点,不论是医生或患者都乐意接受[4]，只需在局麻或不需麻醉下即可进行，避免手术显露骨缺损区影响血供而间接地促进了骨愈合，有希望应用于临床，特别是对于胫骨中下段、软组织条件差的骨不连就更有价值了。②作为液态的藻酸钠可通过侧向交联作用更灵活地使藻酸钙载体凝结为不同形状，以满足不同的临床及实验需要，其力学强度与钙浓度和藻酸盐浓度均有关，在钙离子浓度高达500 mmol/L或藻酸盐浓度达4%时对生物活性物质的渗透扩散仍无阻碍作用[14]。可见，该凝胶不仅具有适针性、可注射性，还有理想的可塑性。③可靠的成骨效应。在本实验的整个过程中，实验组成骨均较对照组活跃，骨再生迅速，质量好，12周时已可见骨髓腔样结构，说明由于理想的细胞外基质材料的存在，给成骨细胞的生长增殖及代谢创造了一个良好的微环境。
本实验采用的是同种异体成骨细胞，术后4周时可见炎性细胞和巨噬细胞侵润， 8周时消失，这可能与异体成骨细胞和藻酸钙凝胶均有关系，但这种免疫排斥反应较轻微，实验动物生长良好，且对骨修复无明显影响。由于体外细胞培养费时、费力，临床上若行自体细胞回植，给患者带来的痛苦和经济负担未必比直接开放手术轻，但若采用同种异体成骨细胞移植，随着细胞冻存复苏技术的日益完善及免疫医学的发展，临床治疗会变得真正简便可行。本实验为今后临床采用同种异体来源的成骨细胞修复骨缺损提供了可能性。
本实验构建的组织工程骨成骨确切、可靠，虽然有较多优点，但实验过程中尚有许多疑难亟待解决，如藻酸钙凝胶在体内降解过程和成骨的关系，注射该凝胶的时间、频率，最适细胞浓度等，相信在今后的进一步研究中这些问题一定会得到解决。

1 Einhorn TA. Enhancement of fracture-healing. J Bone Joint Surg Am 1995;77(6):940-956
2 Gauthier O, Boix D, Grimandi G, et al.A new injectable calcium phosphate biomaterial for immediate bone filling of extraction sockets: a preliminary study in dogs. J Periodontol 1999;70(4):375-383
3 Mak K, Toriumi DM. Injectable filler materials for soft-tissue augmentation. Otolaryngol Clin North Am 1994;27(1):211-222
4 Song SL,Zhu SX,Zhang BX,et al.Zhonghua Guke Zazhi 1997;17(11):696-698
宋守礼，朱盛修，张伯勋，等.经皮注射自体骨膜细胞修复骨缺损的实验研究[J].中华骨科杂志，1997，17(11)：696-698
5 Diduch DR, Coe MR, Joyner C, et al.Two cell lines from bone marrow that differ in terms of collagen synthesis, osteogenic characteristics, and matrix mineralization. J Bone Joint Surg Am 1993;75(1):92-105
6 Simmons DJ, Kent GN, Jilka RL, et al.Formation of bone by isolated, cultured osteoblasts in millipore diffusion chambers. Calcif Tissue Int 1982;34(3):291-294
7 Yao ZQ,Zeng CM,Tang JQ,et al.Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi 1994;8(3):168-170
姚振强,曾才铭，唐景清，等.骨膜成骨细胞的分离培养及其成骨作用的放射自显影研究[J].中国修复重建外科杂志，1994，8(3)：168-170
8 Yu XJ,Yang ZM,Ma JR.Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi1998;12(6):350-353
余希杰，杨志明，马骏荣. 成骨细胞的细胞社会学特性[J].中国修复重建外科杂志，1998，12(6)：350-353
9 Marler JJ, Guha A, Rowley J, et al.Soft-tissue augmentation with injectable alginate and syngeneic fibroblasts. Plast Reconstr Surg 2000;105(6):2049-2058
10 Yang WD,Li SB,Chen FL,et al.Zhonghua Kouqiang Yixue Zazhi 2001;36(2):102-105
杨维东，李石保，陈富林，等.可注射性组织工程软骨的研究[J].中华口腔医学杂志，2001，36(2)：102-105
11 Majmudar G, Bole D, Goldstein SA,et al. Bone cell culture in a three-dimensional polymer bead stabilizes the differentiated phenotype and provides evidence that osteoblastic cells synthesize type III collagen and fibronectin. J Bone Miner Res 1991;6(8):869-881
12 Paige KT, Cima LG, Yaremchuk MJ,et al. Injectable cartilage. Plast Reconstr Surg 1995;96(6):1390-1398
13 Yoshikawa T, Ohgushi H, Nakajima H, et al.In vivo osteogenic durability of cultured bone in porous ceramics: a novel method for autogenous bone graft substitution. Transplantation 2000;69(1):128-134
14 Zheng L,Wang Q,Pei GX.Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi2000;14(3):175-180
郑磊，王前，裴国献.可降解聚合物在骨组织工程中的应用进展[J]. 中国修复重建外科杂志，2000，14(3)：175-180