新型生物复合材料聚乙烯醇/纳米羟基磷灰石+聚己二酰己二胺修复关节软骨及软骨下骨缺损的生物力学研究☆

郭涛1，杨天府2，肖杰1，龙浩1，陈艺新1，裴福兴2，李玉宝3

1贵阳市第四人民医院骨科，贵州省贵阳市 550002；2四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610041；3四川大学纳米分析测试中心，四川省成都市 610041

郭涛☆，男，1971年生，湖北省老河口市人，汉族，2007年四川大学华西临床医学院毕业，博士，副主任医师，主要从事骨损伤修复及组织工程的研究。
guotao04b@sina. com

摘要
目的: 探讨新型生物复合材料聚乙烯醇/纳米羟基磷灰石+聚己二酰己二胺(Polyvinyl alcohol hydrogel/ nano- hydroxyapatite+ polyamide66，PVA/n-HA+PA66)修复兔关节软骨及软骨下骨缺损的生物力学性能。
方法：实验于2006-01/2007-05在四川大学华西医院骨科组织工程实验室完成。①通过原位合成技术及冷冻-融合循环方法制备PVA/n-HA+PA66，并检测材料体外力学性能。②在兔股骨关节面上打孔，包括关节表面软骨和软骨下骨，制成关节软骨缺损的模型。将PVA/n-HA+PA66复合材料植入兔膝关节，对侧肢体打孔作空白对照组或单纯PVA植入，分别于植入12，24周后行局部组织学切片观察，扫描电镜观察，生物材料体内力学性能测试。
结果: 36只兔全部进入结果分析。①上层材料在100 mm/min拉力状态下，抗拉强度为3.42 MPa，下层材料的抗拉强度为6.33 MPa。上层材料在3 mm/min的压力强度下，抗压强度为3.12 MPa。下层材料的抗压强度为5.3 MPa。②生物复合材料植入动物体内12，24周，下层材料中有骨组织长入，上层材料与下层材料紧密连接；生物复合材料在5 mm/min的冲击强度下，其抗冲击强度在植入12周时已达正常松质骨抗冲击强度。
结论：新型生物复合材料PVA/n-HA+PA66修复兔关节软骨及软骨下骨缺损具有良好的生物力学性能。
关键词：生物复合材料；关节软骨；软骨下骨；修复；生物力学

郭涛，杨天府，肖杰，龙浩，陈艺新，裴福兴，李玉宝.新型生物复合材料聚乙烯醇/纳米羟基磷灰石+聚己二酰己二胺修复关节软骨及软骨下骨缺损的生物力学研究[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(6):1051-1054
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1051(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)06-01051-04

Biomechanics study of polyvinyl alcohol hydrogel/nano-hydroxyapatite + polyamide66 in repair of articular cartilage and subchondral bone defects

AIM:To observe mechanical properties of a new type of composite material polyvinyl alcohol hydrogel/ nano-hydroxyapatite + polyamide66 (PVA/n-HA+PA66) on repair of rabbit knee joint articular cartilage and subchondral bone defects.
METHODS: Experiments were performed at the Tissue Engineering Laboratory, Department Orthopedics, West China Hospital, Sichuan University from January 2006 to May 2007. ①New type biological composite materials (PVA/n-HA+PA66) were prepared by in situ synthesis technique and freezing-fusing circulation method. Mechanical property was measured. ②The animal models of defect of articular cartilage and subchondral bone were made up by drilling a hole and PVA/n-HA+PA66 were implanted into the rabbit knees. Drilling a hole at opposite side was performed as controls or only implanting PVA into the hole. The histological evaluation, scanning electron microscope (SEM) and mechanical properties in vivo were performed at weeks 12 and 24.
RESULTS: All 36 rabbits were included in the final analysis. ①The upper layer material strength of resisting-draw was 3.42 MPa and the lower layer was 6.33 MPa under 100 mm/min pulling force. The strength of resisting press was 3.12 MPa and the lower layer material strength of resisting press was 5.3 MPa under 3 mm/min pressing force. ②At weeks 12 and 24 bone tissue were found growing into lower layer materials. The upper layer materials connected tightly with the lower layer materials. The strength of resisting lash of composite materials reached to the strength level of normal bone's resisting lash at 12 weeks under the state of 5 mm/min lashing force.
CONCLUSION: The new type biological composite materials PVA/n-HA+PA66 have good biomechanics properties on repair of rabbit knee joint articular cartilage defects and subchondral bone defects.

Guo T, Yang TF, Xiao J, Long H, Chen YX, Pei FX, Li YB.Biomechanics study of polyvinyl alcohol hydrogel/nano-hydroxyapatite + polyamide66 in repair of articular cartilage and subchondral bone defects.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(6):1051-1054(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1051(ps).pdf]

关节软骨全层损伤往往并发软骨下骨损伤，目前对这种软骨合并软骨下骨的损伤治疗困难，效果欠佳。聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol hydrogel，PVA)是由聚醋酸乙烯酯水解而成的一种水溶性聚合物，目前普遍被认为是关节软骨良好的替代材料[1]。具有骨传导特性的纳米羟基磷灰石（nano- hydroxyapatite，n-HA）与有机质高分子聚己二酰己二胺（polyamide66，PA66）进行共溶而制成的高分子聚合物（n-HA+PA66），是具有中国自主知识产权和国际领先水平的新型纳米粒晶的骨修复替代材料[2]，本实验将PVA与n-HA+PA66有机地结合起来，制备成PVA/n-HA+PA66一体化复合材料，探讨新型生物复合材料修复兔关节软骨及软骨下骨缺损的生物力学性能。

设计: 随机分组设计、对照动物实验。
单位: 四川大学华西医院骨科。
材料: 实验于2006-01/2007-05在四川大学华西医院骨科组织工程实验室（省级重点实验室）完成。选择成年健康新西兰大白兔36只，雌雄各半，兔龄5～8个月，体质量160~240 g，平均182 g，由四川大学实验动物中心提供（许可证号SCXK（川）2004-14）。将新西兰大白兔按随机数字表法分为3组，PVA/n-HA+PA66植入组、单纯PVA植入组、空白对照组，每组12只。生物复合材料PVA/n-HA+PA66由四川大学分析测试中心制备并提供。
设计、实施、评估者: 设计为第一作者, 实施为全部作者, 评估为第一作者, 评估者经过正规培训。
技术路线：
新型生物复合材料PVA/n-HA+PA66的制备：通过原位合成技术及冷冻-融合循环方法制备PVA/n-HA+PA66。用质量分数为0.05的碘伏浸泡，体积分数为0.75的乙醇溶液脱碘，生理盐水清洗后备用。
动物实验：质量分数为0.03的戊巴比妥行腹腔麻醉后，消毒，铺巾，经髌旁内侧入路暴露髌股关节面，在股骨关节面上打孔，直径5 mm，深度5 mm，制成关节软骨缺损的模型。植入PVA/n-HA+PA66，用嵌入器轻轻打压，对侧肢体打孔直径5 mm×5 mm，作空白对照组或植入单纯PVA，缝合伤口，所有术肢不予固定，任其自由活动。分别于术后12，24周麻醉后各处死12只动物，取材。
材料的体外力学性能测试：在Reger 3050万能材料试验机（深圳瑞格公司）上进行拉伸试验，拉伸速率为100 mm/min；另外，在该材料试验机上进行压缩试验，速度为3 mm/min，采用平头圆柱压头测定材料的抗压强度。
PVA/n-HA+PA66材料植入兔膝关节后局部组织形态学观察：取出股骨髁标本，以移植材料为中心，截取长度约为1 cm大小标本，标本经固定，脱钙，常规脱水，包埋，石蜡切片厚度为5 μm，行苏木精-伊红染色，Masson染色及甲苯胺蓝染色，显微镜下观察材料周边组织变化。
扫描电镜观察：取术后12，24周标本，修整成0.5 cm× 0.5 cm×0.5 cm大小样本，戊二醛固定，乙醇梯度脱水，喷金，用扫描电镜观察材料表面，材料与周边软骨及软骨下骨连接界面的情况。
生物力学测试：术后12，24周麻醉后处死动物，取3组动物股骨髁，修整股骨髁为长方块状，平放，在万能材料测试机上以直径5 mm平头钻加压向下行冲击试验，了解材料与周边组织结合情况及抗冲击强度，加载速度5 mm/min，达6 mm停止加载，另取成年兔股骨髁标本6个，为正常组，在相同位置以相同加载速度行冲击试验。
主要观察指标: ①材料的形貌特征及结构。②材料的体外力学性能。③PVA/n-HA+PA66材料植入兔膝关节后局部组织形态学。④扫描电镜观察材料表面，材料与周边软骨及软骨下骨连接界面的情况。⑤体内生物力学性能。
统计学方法: 数据用_x±s表示，由第一作者采用SPSS 10.0统计学软件对检测结果的数据行多个样本均数的两两比较的 q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 材料的大体形态观察及特性 ①PVA/n-HA+PA66生物复合材料，规格直径5 mm×5 mm，圆柱体，上层PVA高度为1.5 mm，乳白色，光滑，质韧，下层n-HA+PA66表面粗糙，质硬，高度为3.5 mm，见图1。PVA为多孔网状结构，孔径为5~40 μm，孔隙率为75.3%，含水率为71.6%，n-HA+PA66为多孔网状结构，孔径100~400 μm，孔隙率61.7%。②单纯PVA上层材料，规格直径5 mm×5 mm。

2.3 组织形态学观察 PVA/N-HA+PA66植入组：12周时，下层n-HA+PA66网孔材料中大量组织填充，并已形成类骨质成分，与周边组织间隙消失，连为一体，见图2a。周边关节软骨朝向PVA表面生长爬行，周边软骨无退行性变。24周时，下层材料与周边组织融为一体，网孔中有大量类骨质，成熟骨小梁，相互连接成网状板层，上层PVA未见磨损，周边软骨未见明显退行性变，见图2b。单纯PVA植入组：12周时，PVA材料部分下陷，周边间隙由纤维组织填充，但材料极不稳固，易脱落，周边软骨部分变薄，回缩、退行性变。24周时，PVA与部分周边软骨间隙加大，材料不稳定，周边软骨有明显退行性变。空白对照组：12周时，缺陷处由纤维肉芽组织逐渐填平，但表面凹凸不平，主要为纤维软骨成分，未形成透明软骨。24周时，缺损部位下部大部分已钙化，形成骨小梁及类骨质结构，上层软骨细胞少，表面不平，内部结构紊乱，周边软骨退行性变严重。

2.4 扫描电镜观察 PVA/N-HA+PA66植入组：12周时，可见下层材料n-HA+PA66网孔中有大量成骨细胞及类骨质形成，类骨质排列为条状，材料与周边组织间隙中充满成骨细胞及胶原成分；PVA下层材料周边有部分纤维组织并钙化。24周时，下层材料网孔中充满大量类骨质成分，网孔与周边组织贯通，并紧密相连，上层材料PVA与下层材料嵌合紧密，见图3。

单纯PVA植入组：12周时，PVA材料与周边组织无连接，界限清楚，PVA上层有部分纤维条索组织覆盖。24周时，周边骨质有部分退缩，间隙加大。空白对照组：12周时，缺损处下部由骨质充填，形成软硬的骨质成分，表面为一层纤维组织覆盖，24周时，缺损处下部由骨质充填，上部为纤维瘢痕样组织，组织结构排列紊乱。
2.5 体内生物力学测试结果见表2。

关节软骨是无血管、淋巴管和神经的组织，通常情况下软骨细胞不能进行有丝分裂，这导致自身修复能力有限[3-4]。根据软骨自身的结构和特点，作为人工软骨的替代材料应满足下列要求：良好的生物力学性能；优良的润滑性和耐磨性；软骨细胞生长诱导性；与骨基底牢固的连接性和生物相容性[5]。
3.1 PVA材料的生物力学性能 PVA是由聚醋酸乙烯酯水解而成的一种水溶性聚合物，通过一定工艺加工成型的PVA水凝胶以其高弹性、化学性质稳定性与人体组织良好的相容性在生物医学方面获得了诸多的用途[6]。但普通PVA水凝胶的最大缺陷是力学性能的不足，但人们很快发现通过适当的成型方法可以有效地提高其力学性能。增加PVA水溶液度并对试样进行真空脱水时，试样的结晶度增加，抗拉强度提高，弹性模量也提高；对试样做辐射交联时，结晶度减小，但抗拉强度提高，弹性模量提高。这说明材料的结晶度和交联程度对材料力学性能均有影响，应用新工序可以制得性能良好的材料，使其更接近人体组织[7-8]。
本实验证实采用反复冷冻融化、真空脱水等制造工艺可提高这种水凝胶的机械性能。Williams[9]也曾对这种材料做过粉碎、拉伸及压缩实验以评价其力学性能，结果显示PVA水凝胶弹性体具有与人关节软骨相似的力学性能，其压缩强度>3 MPa，压缩弹性模量<15 MPa，摩擦系数0.05，磨损系数<5×10 mm/N·m；人关节软骨压缩强度4 MPa，压缩弹性模量为14.4 MPa，摩擦系数0.001,磨损系数<5×10 mm/N·m，PVA水凝胶的含水率为也接近于人关节软骨的75%。
本实验中，PVA为多孔网状结构，在100 mm/min强度下，抗拉强度为3.42 MPa，在3 mm/min强度下抗压强度为3.12 MPa，由于其良好的柔韧性和高弹性，与软骨弹性模量相似，且表面摩擦系数小。因此，PVA水凝胶目前普遍被认为是关节软骨良好的替代材料[1]。
3.2 n-HA+PA66的生物力学性能 n-HA浆料与聚酰胺66在溶剂中复合，得到了与自然骨结构相似，强度和模量相匹配的n-HA+PA66纳米仿生复合材料[10]。n-HA/PA66复合材料中，n-HA为纳米级羟基磷灰石，有均匀的晶体结构，内部结构均一，有很强的力学性能，与PA66结合后形成了与动物骨相似的无机与有机成分，这类材料既具有PA66的柔韧性，又具有n-HA的生物活性和生物相容性，能够和骨形成较强的键合。通过对该材料物理化学性能测试，表明这种复合材料无论在力学性能还是化学组成上都与自然骨相似[11-15]。
本实验中应用的n-HA/PA66被加工成多孔材料，选用含羟基磷灰石（质量分数为0.6）的纳米级羟基磷灰石/ 聚酰胺复合材料，其中羟基磷灰石含量与人体自然骨中羟基磷灰石（质量分数为0.62）基本一致，其力学强度与松质骨相当。
3.3 PVA/n-HA+PA66生物复合材料的生物力学特点正常关节软骨下方的软骨下骨和松质骨对保护关节软骨避免高应力损伤起重要作用。当关节负重大时，关节软骨下骨产生骨骼变形,增大了接触面积，即负重面积。同时，软骨下骨将大部分应力传给下方呈放射状排列的松质骨，从而使关节软骨承受的应力大大降低。Brittberg等[16]指出由于软骨缺损常深达软骨下骨，使它的正常结构受到破坏，导致力学性能的改变，最终使修复组织早期愈合率降低并出现退行性变。因此作为替代关节软骨的PVA水凝胶必须有良好的软骨下骨和松质骨的支撑。
本实验设计为一种生物活性骨固定人工软骨材料，上层为PVA，下层为n-HA+PA66，两者采用洗铸法及冷冻-融化循环法，使PVA与下层n-HA+PA66界面牢固连接。下层n-HA+PA66为多孔网状结构，其网孔直径为100~ 400 μm，可适合纤维组织、骨组织长入，形成牢固的生物自锁固定，可以有效地防止植入体随时间推移而发生移动错位，大大提高了人工软骨材料的稳定性和功能。
本实验表明，在12周时，n-HA/PA66材料中已有大量类骨质形成，材料与周边组织间隙消失，材料与周边软骨下骨连为一体。12周时其抗冲击强度基本接近正常关节软骨下骨，而在24周时，抗冲击强度更进一步加强，提示材料与周边骨组织牢固性加强。纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料力学强度和自然骨组织基本一致，复合材料作为承重骨缺损的修复和替代品，可克服现有金属聚合物、陶瓷修复体存在的力学性能与人骨不匹配造成骨吸收、骨质疏松或植入体松动、体内发生疲劳破坏等缺点[17]。
总之，PVA/n-HA+PA66生物复合材料在修复关节软骨时，表现出了良好的生物相容性和良好的生物力学性能，虽然还不能使关节软骨完全再生修复，但它可以明显降低软骨的磨损，改善负重功能，从而延缓甚至阻止创作关节炎的发生与发展，具有潜在的临床应用前景[1,18]。但PVA水凝胶材料修复后的长期磨损问题还需要进一步深入研究。

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