以口腔黏膜刺激试验检测碳化硅种植材料的生物安全性★

刘文伟1，王弢1，战德松2

1沈阳市口腔医院种植修复中心，辽宁省沈阳市 110002；2中国医科大学口腔医院修复科，辽宁省沈阳市 110002

刘文伟★，男，1976年生，辽宁省沈阳市人，汉族，2007年中国医科大学口腔医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事口腔种植的研究。
wwliu0@sina.com

摘要
目的: 寻找一种陶瓷材料替代金属材料成为种植体核心材料。以口腔黏膜刺激试验作为二级试验，观察碳化硅种植材料的生物安全性。
方法：实验于2007-03/06在沈阳药科大学药理实验室完成。选择雄性家兔25只，双侧颊黏膜无病变。将碳化硅种植材料制成直径为5 mm，厚度为1 mm圆片，阴性对照为牙胶材料，阳性对照为工业用聚氯乙烯。用医用无创伤缝合线将试件固定于家兔口腔双侧颊黏膜上，一侧为阳性对照物，另一侧为碳化硅试件和阴性对照物。术后2周观察动物有无全身不良反应，另外每日观察圆片接触局部的黏膜反应，有无色泽异常、充血、糜烂、渗出等异常现象。2周后麻醉后处死动物，取与试件直接接触部位颊黏膜全层组织，行苏木精-伊红染色观察其组织学改变。
结果：纳入动物25只，均进入结果分析。①大体观察：碳化硅试样圆片固定良好，局部黏膜表面完整清晰，无异常反应如充血、出血、糜烂、溃疡等，与阴性对照无明显差异；阳性对照工业用聚氯乙烯圆片与家兔的颊黏膜表面出现了一定程度的充血、水肿。②组织学观察：碳化硅试件组和阴性对照组的黏膜被覆复层鳞状上皮，表面角化，未见上皮钉突伸长、黏膜表面过度角化、棘层增生等异常变化，基底膜完整，下方毛囊丰富，固有层纤维细胞组织致密，未见炎细胞，黏膜下层肌肉丰富。阳性对照组被覆复层鳞状上皮，紧接基底膜区可见炎细胞散在浸润，肌纤维旁、腺体内均可见炎细胞散在浸润，中性粒细胞为主、少量嗜酸细胞浆细胞，腺胞萎缩消失，导管增生扩张，局部中性粒细胞灶性浸润，血管内可见中性粒细胞，毛囊周围有中性粒细胞包绕浸润。
结论：碳化硅种植材料对实验动物颊黏膜无不良刺激反应。
关键词：碳化硅；种植；生物安全性；黏膜刺激；生物材料

刘文伟，王弢，战德松.以口腔黏膜刺激试验检测碳化硅种植材料的生物安全性[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(6):1059-1062 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1059(ps).pdf]

Biosafty of SiC implant material evaluated by oral mucous membrane irritation test

AIM:To find out a kind of ceramic material to substitute metal material for implants. This study was to evaluate the biocompatibility of the SiC implant material with the oral mucous membrane irritation test.
METHODS: The experiment was carried out in the Pharmacological Laboratory of Shenyang Pharmaceutical University between March and June in 2007. Twenty-five male rabbits were used in this study, without bilateral cheek mucous membranes. The SiC implant material was made into wafers with 5 mm diameter and 1 mm thickness, as the test material; while gutta percha was taken as negative control, and polyviny chloride (PVC) as positive control. All the materials were fixed to the oral cheek mucous membrane of healthy rabbits with medical non-invasive suture, positive control on one side whereas SiC material and negative control on the other side. In two weeks, the general reaction and the oral mucous reaction in contacted site were observed, such as color, hyperaemia, erosion, and effusion. All the rabbits were sacrificed under anesthesia two weeks later, and the whole tissue of cheek mucous membrane in the directly contacted site were harvested and detected by hematoxylin-eosin staining for histological changes.
RESULTS: All 25 rabbits were involved in the result analysis.①SiC test piece was fixed well, part of mucous membranes were complete and clear. There was no abnormal reaction such as hyperaemia, haemorrhage, erosion, and ulcer. No significant difference was found compared with negative controls. But there were obvious hyperaemia and edema in the site where PVC was implanted.②In the SiC group and negative control group, the mucous membranes were coated with stratified squamous epithelia and showed cuticularization. No elongated epithelial peg, hyperkeratosis or hyperacanthosis was visible. The basal lamina was complete and abundant in folliculus pili, and fibrocyte tissues were dense in proper lamina without the inflammatory cells. There were plenty of muscles in inferior mucous. In the positive control group, the stratified squamous epithelia coating was observed, inflammatory cells infiltrated in the basement membrane zone, surrounding the muscle fibers, and in glandular organ. Heterophil granulocyte was dominant, accompanied by few acidocytes. Glandular cells shrank and even disappeared, ductal hyperplasia distended. Parts of heterophil granulocytes infiltrated in vessels and surrounding folliculus pili.
CONCLUSION: The SiC implant material has no adverse irritation reaction to the cheek mucous membrane of animals.

Liu WW, Wang T, Zhan DS. Biosafty of SiC implant material evaluated by oral mucous membrane irritation test.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(6):1059-1062(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1059(ps).pdf]

目前种植体材料以钛及钛合金为主，具有质轻，弹性模量低，硬度、极限抗拉（张）强度、屈服强度和疲劳强度均高等优点。但金属同体液有电化学反应，脱下的金属离子可以扩散到邻近的组织内，影响纤维细胞的生长速度和骨的形成，甚至导致骨吸收，影响骨整合[1]。生物陶瓷由于具有强度高、耐腐蚀、无刺激性和毒性、
与组织亲和性好等特点，在众多的人工牙根新材料中，占有重要的地位[2]。生物陶瓷类种植体
相对于金属种植体有许多优点：生物陶瓷的润湿性能好，其与组织的结合性能优于金属种植体，生物陶瓷种植体有适当的孔隙，这种孔隙为纤维细胞，骨细胞向种植体中生长提供通道和生长场所。增大组织液与种植体之间的接触表面积，加速反应过程，孔隙利于局部体液循环，为长入材料深部的新生骨提供营养；纤维及骨组织长入孔隙中有机械锁结和固位种植体的作用[3]。
本实验主要观察碳化硅种植材料的生物安全性，确定其在应用于人体，与人体组织相接触时，材料对人体是否无毒性、无刺激性、无致癌性和致畸变等作用。根据IS07405-1997“牙科学-用于牙科的医疗器械生物相容性临床前评价-牙科材料实验方法”国际标准[4]，以口腔黏膜刺激试验作为二级试验，为其临床应用提供依据。

设计：对照观察。
单位：沈阳市口腔医院种植修复中心，中国医科大学口腔医院修复科。
材料：实验于2007-03/06在沈阳药科大学药理实验室完成。选择家兔25只，雄性，体质量2.0~3.0 kg，双侧颊黏膜无病变。实验材料：碳化硅种植材料（中科院沈阳金属研究所研制并提供），工业用聚氯乙烯片（东莞市洪威工业材料有限公司），牙胶片（上海齿科材料厂）。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第一作者，评估者经过正规培训。
技术路线：
口腔黏膜刺激试验[5]：
试件制备：将碳化硅种植材料制成直径为5 mm，厚度为1 mm圆片，阴性对照为牙胶材料，阳性对照为工业用聚氯乙烯，均调磨光滑圆钝。圆片中间用高速手机打两个直径0.5 mm小孔，以备缝合固定[6]。所有材料均用体积分数为0.95的乙醇超声清洗20 min，再用蒸馏水清洗3遍，烘干备用，见图1。

缝合固定：先用30 g/L戊巴比妥钠对家兔进行腹腔内注射麻醉，将实验动物固定于操作台上，用2.5 g/L洗必泰进行口腔内外消毒，用医用无创伤缝合线将试件固定于家兔口腔双侧颊黏膜上，一侧为阳性对照物，另一侧为碳化硅试件和阴性对照物。术后饮食正常，饮水中补充0.8 g/L抗坏血酸[6]，见图2。

实验观察：缝合固定后观察2周，观察动物有无全身不良反应，另外每日观察圆片接触局部的黏膜反应，有无色泽异常、充血、糜烂、渗出等异常现象，见图3。

组织切片：2周后麻醉后处死动物，取与试件直接接触部位颊黏膜全层组织，用40 g/L甲醛溶液常规固定、石蜡包埋切片、苏木精-伊红染色，病理组织学观察。根据国家规定将组织反应分级[7]，并与阴性对照组进行对比。
主要观察指标：术后2周进行大体观察及与试件直接接触部位颊黏膜的组织学变化。

2.1 实验动物数量分析纳入动物25只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 大体观察术后两三天动物饮食较差，其余时间动物活动正常，饮食正常。碳化硅试样圆片固定良好，局
部黏膜表面完整清晰，无异常反应如充血、出血、糜烂、溃疡等，与阴性对照无明显差异，但阴性对照牙胶圆片有3片脱落；阳性对照工业用聚氯乙烯圆片与家兔的颊黏膜表面出现了一定程度的充血、水肿。
2.3 组织学观察碳化硅试件组和阴性对照组的黏膜被覆复层鳞状上皮，表面角化，未见上皮钉突伸长、黏膜表面过度角化、棘层增生等异常变化，基底膜完整，下方毛囊丰富，固有层纤维细胞组织致密，未见炎细胞，黏膜下层肌肉丰富。见图4。

阳性对照组被覆复层鳞状上皮，紧接基底膜区可见炎细胞散在浸润，肌纤维旁、腺体内均可见炎细胞散在浸润，中性粒细胞为主、少量嗜酸细胞浆细胞，腺胞萎缩消失，导管增生扩张，局部中性粒细胞灶性浸润，血管内可见中性粒细胞，毛囊周围有中性粒细胞包绕浸润。见图5。

种植牙能减少基托或免除基托，并能最大程度地恢复咀嚼功能，促进骨组织代谢，延缓牙槽骨的吸收，改善患者的生活质量。种植体在材料学方面主要分为金属及其合金、陶瓷、高分子材料和碳[8]。钛是目前口腔牙种植种应用最广泛的生物材料。它能提供好的生物相容性，达成目前所有材料中最好的骨整合和生物结合[9]。钛的表面形成的氧化层虽然能阻止离子的释放，但是科学家发现在髋关节钛植入后，人体各组织器官会检测到浓度偏高的钛合金中的离子。因此设想在陶瓷类材料中寻找一种适合进行种植的材料。碳化硅材料属于生物惰性陶瓷，这类陶瓷在生物体内化学性质稳定，无组成元素溶出，对机体组织无刺激性[10]。口腔材料应用于临床前其生物性能应符合以下条件:①生物安全性(biological safety):指材料进入临床应用前具有安全使用的性能。②生物相容性(biocompatibility):指在某种特定的目的、特定的部位材料与宿主同处于静动态变化环境中发生相互反应的能力和作用，保持相对稳定而不被排斥的性质，又称生物适应性和生物可接受性。生物相容性是生物安全性的基础上具备的另一种重要性质。③生物功能性(biofuncationability):指材料应具有生物安全性和生物相容性外，还应具有生物功能性而发挥最大的生理功能，是材料与宿主产生功能反应(活性反应)的总称[11]。本实验根据IS07405-1997“牙科学-用于牙科的医疗器械生物相容性临床前评价-牙科材料实验方法”国际标准[4]，以口腔黏膜刺激试验作为二级试验或应用前试验，为其临床应用提供依据。
口腔黏膜刺激试验是评价与口腔黏膜短期或长期接触的材料对黏膜产生的刺激作用。该实验已被国际标准化组织列为评价口腔材料生物安全性的必需实验。这类实验大多采用金黄地鼠作为实验动物，金黄地鼠属地鼠，又称仓鼠，颊囊位于口腔两侧，由一层薄而透明的肌膜组成，用以运输和储藏食物，容易牵引翻脱，黏膜对致癌物反应非常敏感，金黄地鼠是肿瘤学研究中最常用的动物[12]。但因金黄地鼠易携带病原微生物，本实验根据相关标准[5]选择家兔作为实验动物。本实验为了防止缝线不牢固，易与口腔黏膜脱离而采用深层缝合，且将缝合在同一侧的两种试件保持在2 mm的距离，这样防止产生交叉反映从而干扰试验结果。术中采用无创缝合线进行缝合而且在术后给与少量的抗生素，能够最大限度的防止产生线头反应。在结果分析方面，以往的标准曾将黏膜刺激进行分级，判定材料是否具有黏膜刺激性[7]。本实验采用新标准[5]经过2周的观察及组织切片并未发现受试物样品与阴性对照有任何不同，说明实验材料无明显黏膜刺激性。
对于牙科材料生物安全性的评价，国际上提出分3个步骤进行，即初期筛选试验、第二阶段试验及临床应用前试验[13]。对于口腔种植材料，口腔黏膜刺激试验只能第二阶段试验，在应用于临床前还应进行植入试验确定该种植材料是否能与骨发生骨结合以及骨结合的强度。碳化硅材料属于惰性陶瓷材料，不具有骨诱导性，还可在这些试验的基础上，将碳化硅材料制成多孔形式，在其上加载具有骨诱导功能的材料如骨形态发生蛋白2促进骨结合。
结论：碳化硅种植材料对实验动物颊黏膜无不良刺激反应。

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