电纺漏斗网蜘蛛丝纤维性能及体外细胞生物学性能***★

薛永峰1,2, 何创龙2 , 张磊2，莫秀梅1,2, 李廷辉3

课题背景：本课题为2005年国家自然科学基金资助项目（30570503）和上海科学与技术委员会资助项目（05DJ14006，05PJ14013）支持。课题负责人莫秀梅教授多年来先后在日本京都大学、新加坡国立大学和德国亚琛工业技术应用大学从事血管组织工程支架材料的研究。主要成果包括甲壳素结晶度的计算，结晶结构的表征，抗凝血甲壳素的化学改性，新型医用胶粘合剂的开发，骨及软组织支架材料的快速成型，纳米纤维用于再生医学。

相关链接：Prince 等利用大肠杆菌E-coli表达了与Neph lia Clavipe牵引丝蛋白Spidroin 1 和Spidroin 2 同源的重复序列聚合物；美国的杜邦公司正集中力量研究用细菌作代理寄主的技术，希望能利用细菌生产蛛丝蛋白纤维；也有科学家把蜘蛛牵引丝部分的基因注入到蚕卵中，这样家蚕吐出的丝就类似于蜘蛛丝；国内的研究人员则把蜘蛛丝蛋白基因注入到老鼠中，从小白鼠的乳汁中获取蛋白。据报道德国Catersleben 研究所的科学家制造了人造蜘蛛丝的蛋白基因变体, 然后将这些变体接入到植物（如土豆等）的基因组中, 发现丝蛋白在蛋白质总量中占2% 以上。

偏倚或不足：受原材料量的制约，材料的降解性能测试还存在不足，没能测试纤维膜在经过不同降解时间后的力学性能，所以只能从形态上进行分析。

1东华大学材料科学与工程学院, 上海市 201620; 2东华大学化学化工与生物工程学院生物所, 上海市 201620; 3南方蜘蛛养殖研究所, 广西壮族自治区南宁市 530012

薛永峰★，男，1979年生，山东省临沂市人，汉族，东华大学材料物理化学专业在读硕士，主要从事静电纺生物材料和组织工程研究。
xueyongfeng@
mail.dhu.edu.cn

通讯作者：莫秀梅, 教授，博士生导师，东华大学材料科学与工程学院, 上海市 201620;东华大学化学化工与生物工程学院生物所, 上海市 201620
xmm@dhu.edu.
com

国家自然科学基金资助项目(30570503)*；上海市浦江人才计划（05PJ14013）*；上海市科委重大专项（05DJ14006）*

摘要
目的: 近年来，蜘蛛丝在基因识别、人工合成以及基因表达上取得的成果，引发了广大研究者模拟天然蜘蛛丝优秀性能的兴趣。采用静电纺技术对制备的漏斗网蜘蛛丝再生纤维膜进行性能检测，为静电纺蜘蛛丝纳米纤维应用于组织工程和生物医学领域提供前期研究。
方法：实验于2006-07/2007-03在东华大学生物研究所生物材料室完成。采用电纺技术制备了漏斗网蛛丝再生纤维膜，对纤维膜的表面形态分析，水解性能，热性能，力学性能进行检测。体外与猪动脉内皮细胞共培养，采用MTT法检测对纤维膜细胞的增殖活性，以相差显微镜和扫描电镜观察细胞的形态变化。
结果：再生蛛丝纤维膜热分解起始温度为279 ℃；在单轴拉伸时断裂强度和断裂伸长率分别为（3.61±0.18）MPa和 (33.20±4.86)%；内皮细胞能够在纤维表面黏附并显示良好的生长形态； MTT结果显示内皮细胞在材料上增殖活跃，培养7 d后，纤维膜上的细胞增殖为对照组的两倍多。
结论：漏斗网蜘蛛丝再生纤维膜显示出稳定的热性能和高的延展性，并能有效促进内皮细胞的黏附和增殖，具有良好的生物相容性。
关键词：静电纺丝；蛛丝；力学性能；表面形态；生物材料

薛永峰, 何创龙, 张磊，莫秀梅,李廷辉.电纺漏斗网蜘蛛丝纤维性能及体外细胞生物学性能[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(6):1067-1071 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1067(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)06-01067-05

Property and biocompatibility of electrospun funnel-web spider silk fibrous mats

AIM:Spider silk shows good properties in gene identification, artificial synthesis and gene expression, which bring high interests of investigators to stimulate natural spinal silk. This paper introduces the preparation of electrospun funnel-web spider silk fibrous mats, and provides basis for the application of nanofibrous mats of electrospun spider silk in tissue engineering and biomedicine.
METHODS: Experiments were performed at the Room of Biomaterial of Institute of Biology of Donghua University from July 2006 to March 2007. Nanofibrous mats of funnel-web spider silks were electrospun. The surface of fibrous mats was analyzed. Hydrolysis, thermal properties and mechanical properties of resulted fibers were investigated. Resulted fibers were cocultured with endothelial cells of porcine artery in vitro. The cell proliferation and cell morphologies were respectively evaluated by MTT method and phase contrast microscope and scanning electron microscope (SEM).
RESULTS: The elelctrospun spider silk mats exhibited a thermal stability below 279 ℃. The breaking stress was (3.61±0.18) MPa and the breaking strain was (33.20±4.86)%. Endothelial cells grew well and could adhere to the surface of fibers. MTT tests showed that endothelial cells proliferated actively. The number of cells on fibrous mats was as twice as that in the control group seven days later.
CONCLUSION: Nanofibrous mats of Funnel-web spider silks process stable thermal properties and high ductility. Electrospun mats exhibit good biocompatibility and can enhance the adhesion and proliferation of endothelial cells.

Xue YF, He CL, Zhang L, Mo XM, Li TH.Property and biocompatibility of electrospun funnel-web spider silk fibrous mats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(6):1067-1071(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-6/6k-1067(ps).pdf]

蜘蛛丝是一种典型的纤维蛋白，具有其他纤维不可比拟的强度大、弹性好、柔软、质轻和生物相容性好等特点[1-2]。单位重量蜘蛛丝的牵引丝的强度是人造纤维aramid的3倍, 是钢材的5倍, 弹性却是尼龙的2倍[3-4]。静电纺丝是一种不同于常规方法的纺丝技术,它通过在聚合物溶液或熔体内施加高压静电,使聚合物溶液或熔体在喷丝口形成Taylor锥 [5-6]。当电场拉伸力克服液滴的表面张力时,形成聚合物射流,由于溶剂挥发最终在接收器上产生类似于无纺布的纤维膜。由于其特殊的原理与工艺,所得纤维直径一般在数十纳米到数微米之间,具有很大的比表面积,因而可广泛用作过滤材料、防护织物、生物医用组织材料和功能性服饰等[7]。Shahrzad等[8]第一次报道了Nephila蜘蛛丝的静电纺丝方法，他们通过用六氟异丙醇溶解Nephila clavipes得到蛛丝溶液，经过静电纺丝得到纳米纤维，该纤维在280 ℃下保持稳定，直径在6.5~200 nm。Ohgo等[9]将蜘蛛丝溶解在六氟丙酮水合物中，采用静电纺丝成功制得了纳米纤维。潘志娟等[10-11]也对静电纺蜘蛛丝的工艺和表征做了很多研究。电纺蜘蛛丝体外生物学性能方面的报道很少，将其用于医用材料前必须进行严格的生物学性能检测。因此，本文采用静电纺技术对制备的漏斗网蜘蛛丝再生纤维膜进行热性能和力学性能检测，并采用猪动脉内皮细胞检测材料的体外生物学性能。

设计：观察性实验。
单位：东华大学生物研究所。
材料：实验于2006-07/2007-03在东华大学生物研究所生物材料室完成。漏斗网蛛牵引丝（广西南宁市南方蜘蛛养殖研究所提供）；六氟异丙醇（HFIP，美国杜邦公司，纯度99.9%）；无水乙醇（≥99.8%，分析纯，上海政创实业有限公司）；EC细胞株（猪髋动脉内皮细胞，中国科学院细胞所提供）；DMEM培养基（杭州吉诺生物技术有限公司），胎牛血清（Gibco，美国），MTT试剂（美国Sigma公司），苏木精-伊红染色试剂盒（海门市碧云天生物技术研究所产品）。
设计、实施、评估者：实验设计为第二作者，资料收集为第一、三作者，实施为第一作者，评估为第二、四作者，评估采用双盲法。
方法：
静电纺漏斗网蜘蛛丝纤维膜制备：把一定量的漏斗网蛛牵引丝溶解在六氟异丙醇中，在温度为40 ℃下磁力搅拌7 d，经150目筛网过滤得到蛛丝溶液，浓度为2%。静电纺丝方法，见图1。将制备的蛛丝溶液加入5 mL注射器针筒中，注射器末端连接18G钝口针头，控制针头和铝箔收集屏之间的距离为11 cm，实验时由高压静电发生器（BGG6-358,北京高电压技术研究所）的阳极输出端直接与针头相连，电压控制为12 kV。电纺时环境温度为18 ℃，相对湿度为56%，纺丝速率为2 mL/h，在收集屏上可获得无纺纤维膜。

表面形态分析：采用日本产JSM-5600LV 型扫描电子显微镜观测,所有样品经表面喷金处理，扫描电压为15 kV。采用图像分析软件ImageJ （National Institutes of Health, USA）对扫描电子显微镜照片中的纤维片断（n=100）进行分析,分析纤维的直径及其分布。
水解性能：把制得的蛛丝纤维膜放在真空干燥箱内过夜干燥后，分4组分别浸入到PBS培养液中，在37 ℃水浴恒温箱内放置7，14，21 d和28 d，取出纤维膜用去离子水冲洗3遍，真空干燥箱过夜干燥。
热性能分析：采用美国PE-TGA7型热分析仪，氮气保护，升温速度为20 ℃ /min，温度测量范围60~400 ℃。
材料的力学性能：采用英国Hounsfield万能拉力机 ( HSK-S, UK)测试。将平整的纤维毡剪成10 mm×50 mm的长条形试样，用螺旋测微器测定其厚度，然后在拉力机（测量精度为0.01 cN）上测试试样力学性能（样品标距为30 mm，拉伸速度为10 mm/min）,实验时室温为（20±1）℃，相对湿度（65±5）%，每
组至少测试5个样品，报告统计值。
纳米膜消毒和细胞培养：采用直径14 mm的圆形载玻片收集电纺纤维，把玻璃片放入24孔培养板后用75%乙醇灭菌4 h，然后用PBS冲洗两次。实验细胞采用EC细胞株，培养基为DMEM高糖培养基加10%胎牛血清和100 U的青霉素和链霉素，放置于体积分数为0.05的CO2的37 ℃孵育箱（BB15, Heraeus, 德国），每隔2.0~3.0 d换液1次。
苏木精-伊红染色法观察样品细胞形态：用4%多聚甲醛固定10 min,蒸馏水洗涤2 min，再用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 min。苏木精染色液5 min，浸自来水中冲洗去多余的染色液，约10 min。蒸馏水再洗涤一遍(数秒钟)，95%乙醇5 s。伊红染色液染色30 s，70%乙醇洗涤2次，显微镜(IX-71倒置荧光显微镜)下观察。
MTT法检测细胞黏附和增殖：将ECs按5×107 L-1浓度接种于24孔培养板中经消毒的蛛丝纤维膜组和对照组（无纳米纤维膜），每孔接种细胞悬液0.5 mL，每组9孔。6 h、2 d和7 d每组各取3孔换加不含血清的培养液360 μL和MTT溶液（5 g/L）40 μL，培养箱培养4 h，吸去孔内培养液，每孔加入400 μL二甲基亚砜，振荡30 min使结晶物溶解。每孔各取二甲基亚砜溶解液100 μL加入96孔酶标板中，然后在酶标仪(MULTSIKAN MK3,Thermo,U.S.)上用492 nm波长段测吸光度值。
主要观察指标：①静电纺漏斗网蜘蛛丝纤维膜的形态结构、水解性能、热性能、力学性能。②静电纺漏斗网蜘蛛丝纤维膜上内皮细胞形态。③静电纺漏斗网蜘蛛丝纤维膜上细胞增殖情况。
统计学方法：实验数据以_x±s表示，由本文作者采用SPSS 11.0软件进行ANOVA分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 静电纺漏斗网蜘蛛丝纤维膜的形态结构静电纺漏斗网蛛丝纤维膜的电镜照片，见图2。

电纺纤维膜纤维分布，见图3。经软件分析得出其平均纤维直径为（146.6±58.5）nm。蛛丝纤维膜的孔隙率较大达到65%左右，有利于细胞的长入。研究表明，人体内细胞外基质本质上是由蛋白和糖氨聚糖交联而成的纳米纤维凝胶网络，纤维直径通常为50~300 nm[12]，因此，制备的蛛丝纳米纤维在尺度上与天然细胞外基质接近。

由图2和图4比较可以看出，4个样品经过4周的降解，降解的程度很小，纤维有明显溶胀现象。经过4周的水降解，材料只是出现了微细纤维和较粗纤维的分支发生断裂，较粗的纤维没有发现断裂，这主要由于微细纤维和粗纤维分叉的比表面积较大，更容易在水分子作用下，丝素纤维蛋白的肽键断裂和分子间的相互作用被破坏。涂桂云研究重组蛛丝蛋白支架体外PBS降解发现，材料随着降解时间的延长，残余重量越来越小，经过5周水解后，支架最终残余重量为77.8%[13]。
2.3 静电纺漏斗网蜘蛛丝纤维膜的热性能分析见图5和图6。

从图5可以看到，从常温到650 ℃，静电纺蛛丝纤维膜的重量的损失分两个阶段。第一阶段温度在100 ℃以下时，重量损失主要为释放吸附水分造成的，重量损失在4%~5%；可以看出静电纺蛛丝纤维膜最快释放水分的温度值为75.2 ℃，这和材料经处理后表面和水分子的键合作用的变化有关系；第二阶段的重量的损失主要为材料的热分解，也就是多肽链中肽键断裂，起始分解温度在279 ℃左右，分解峰值在330 ℃，分解终止温度在376 ℃左右，重量损失在60%左右，尤其是C-N键断裂几率最大,这是因肽键中C-N键能较低，其次C-C键、C-O 键、N-N键亦可发生部分断裂[14]。而从图6可以看出，材料在158 ℃左右发生玻璃化转变，由玻璃态转化为高弹态；同时也可以看出热分解的峰值也是在330 ℃附近。静电纺蛛丝纤维膜的热性能研究，有助于在材料不同的使用过程和用途中的进行比如高温灭菌等的处理提供依据。
2.4 静电纺漏斗网蜘蛛丝纤维膜的力学性能见图7。
由图7可以看出，应力-应变曲线起始段可以看作是，纤维膜在受到拉伸力时，纤维间的相互粘结阻抗纤维沿力的方向排列而产生，纤维的定向排列使应力很大程度增大，进一步的拉伸使分子间产生滑移，产生大的形变；较高的杨氏模量显示出分子间存在较大的相互作用[15]。

据文献报道，人体隐静脉的爆破压在（1 680± 307）mm Hg[16]，即（0.22±0.04） MPa；人体桡动脉血管的拉伸强度为（13.38±2.33）MPa，形变为（21.58± 11.30）%[17]。静电纺漏斗网蛛丝纤维膜拉伸强度为（3.61±0.18）MPa，断裂形变达到（33.20±4.86）%，杨氏模量为（59.64±7.54）MPa，并且其力学特征曲线和胶原纤维相似[18]。
2.5 静电纺漏斗网蛛丝纤维膜上细胞形态倒置荧光显微镜比较清晰地观察到静电纺漏斗网蛛丝纤维膜上经苏木精-伊红染色的内皮细胞形态，见图8。苏木精-伊红染色时，细胞密集区细胞核呈椭圆形，染淡蓝色，胞质染淡红色；密集区边缘和稀疏区的梭形细胞胞核着色深，细胞质粉红色[19-20]。图8a，b，c分别为培养4 h、2 d和3 d的倒置荧光显微镜照片，可清晰观察到细胞的形态，并且随着培养时间的增加，细胞数量也增加；图8 d为细胞经过3 d培养后，单个细胞的扫描电镜图，可以看出ECs在静电纺漏斗网蛛丝纤维膜表面黏附和伸展，并开始向纤维表面空隙迁移，进入膜内部，与此同时，也可以看出细胞与周围纤维相互融合，保持表型并按沿纤维方向生长，具有良好的生长形态。
2.6 静电纺漏斗网蜘蛛丝纤维膜的细胞增殖见图9。
MTT是一种淡黄色唑氮盐，是线粒体脱氢酶的作用底物，经活细胞内线粒体脱氢酶的消化作用，被还原成不溶于水的蓝紫色甲瓒结晶，并沉淀于细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜能够溶解沉积在细胞中的蓝紫色结晶，溶液的颜色深浅与蓝紫色甲瓒的含量成正比，可用分光光度仪测定吸光度值也即其含量，来反映细胞的增殖能力和生长情况。吸光度值大小与活细胞数之间有良好的线性关系[21]。MTT试验定量分析反映了ECs在静电纺漏斗网蛛丝纤维膜上的黏附、生长和增殖情况。如图9所示，培养6 h后蛛丝纤维膜组的细胞数量就已经高于对照组，2 d和7 d后蛛丝膜组细胞数远远高于对照组，特别在7 d后蛛丝纤维膜组的细胞数达到了对照组的2倍多。

本实验通过静电纺技术得到了纳米尺寸的多孔蜘蛛丝纤维膜，尺寸上具有与天然细胞外基质相近的微观结构，极高的比表面积为活性因子释放提供了理想平台[22]。静电纺蛛丝纤维膜显示出稳定的热性能和高的延展性，其力学性能可以满足某些特定部位组织对材料的要求，并且经过4周的降解，从形态上看出材料只是出现了微细纤维和较粗纤维的分支断开，较粗的纤维没有发现断裂，材料能够满足组织支架材料支撑细胞生长时间的需要，提供较长时间的的机械支撑力，保证替代物在体内承受周围组织压力时，再生细胞有足够的时间以长入再生。细胞形态和增殖实验表明，细胞能够很好的在材料上生长，具有良好的生物相容性。初步的研究表明，静电纺蛛丝纳米纤维膜满足可以作为组织工程和生物医学应用的需要。
致谢：本文受到国家自然科学基金(编号30570503)、上海市浦江人才计划(编号05PJ14013)、上海市重大基础研究课题(编号05DJ14006 ),111计划 (B07024)等项目资助与支持，特此感谢！

1 Vollrath F. Spider webs and silks. Sci Am 1992;266: 70-76
2 Bai J, Ma T, Chu W, et al.Regenerated spider silk as a new biomaterial for MEMS. Biomed Microdevices 2006;8(4):317-323
3 Vollrath F, Knight DP. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature 2001;410(6828):541-548
4 Tirrell DA. Putting a new spin on spider silk. Science 1996;271(5245):39-40
5 Krishnappa RVN, Desai K, Sung C. Morphological study of electrospun polycarbonates as a function of the solvent and processing voltage. J Mater Sci 2003;38: 2357-2365
6 Hohman MM, Shin M, Rutledge G, et al. Electrospinning and electrically forced jets. I. Stability theory.Phys Fluids 2001；13(8): 2201-2220
7 Hohman MM, Shin M, Rutledge G,et al. Electrospinning and electrically forced jets.Ⅱ. Stability theory.Phys Fluids 2001；13(8): 2221-2236
8 Zarkoob S，Eby RK，Reneker DH，et al. Structure and morphology of electrospun silk nanofibers. Polymer 2004；45: 3973-3977
9 Ogho K, Zhao C, Kobayashi M, et al. Prepartion of non-woven nanofibers of Bombyx mori silk, Samia cynthia ricini silk and recombinant hybrid silk with electrospinning method. Polymer 2003；44: 841-846
10 Xu Q.Suzhou Daxue 2005
许箐. 再生蜘蛛丝的成丝方法及其结构与性能[D].苏州大学，2005
11 Qiu XW.Suzhou Daxue 2006
邱芯薇. 静电纺再生丝素纤维制品的结构与性能[D].苏州大学，2006
12 Piez KA. Molecular and aggregate structures of the collagens. Extracellular Matrix Biochemistry. New York: Elsevier 1984：1-40
13 Tu GY.Fujian Shifan Daxue 2005
涂桂云. 基因重组蛛丝蛋白作为组织工程支架材料的研究[D]. 福建师范大学, 2005
14 Pan ZJ,Chen YY,Sheng JY,et al.Sichou 2002;10:13-16
潘志娟, 陈宇岳, 盛家镛,等.蜘蛛丝的热性能研究[J].丝绸，2002, 10：13-16
15 Ayutsede J, Gandhi M, Sukigara S, et al. Regeneration of Bombyx mori silk by electrospinning. Part 3: Characterization of electrospun nonwoven mat. Polymer 2005；46: 1625-1634
16 Stankus JJ, Soletti L, Fujimoto K, et al.Fabrication of cell microintegrated blood vessel constructs through electrohydrodynamic atomization. Biomaterials 2007;28(17):2738-2746
17 Zhao BL,Ma HS.Shandong Shengwu Yixue Gongcheng 2004;2(1):33-37
赵宝林，马洪顺. 桡动脉血管生物力学性质实验研究[J]. 山东生物医学工程，2004, 2(1):33-37
18 Wang YJ,Dai KR.Shanghai：Xuelin Publishing House 1985:93
王以进，戴魁戎.胶原组织的生物力学[M].上海：学林出版社，1985：93
19 Ren CL.Hebei Beifang Xueyuan Xuebao：Ziran Kexueban 2006;22(1):61-63
任成林. 几种苏木精-伊红液的改进和应用[J]. 河北北方学院学报：自然科学版，2006, 22 (1): 61-63
20 Wei WK.Shengwuxue Tongbao 2003;38(5):49-50
魏文科. 介绍一种观察凋亡细胞形态学特征的染色方法[J]. 生物学通报，2003, 38(5): 49-50
21 Liu XL,Zhang CX.Kouqiang Cailiao Qixie Zazhi 1999;8(1):10-13
刘晓亮，张彩霞.评价生物材料毒性的体内外实验相关性研究[J].口腔材料器械杂志，1999, 8 (1): 10-13
22 He CL,Huang ZM,Zhang YZ,et al.Ziran Kexue Jinzhan 2005;10(10):1175-1182
何创龙, 黄争鸣, 张彦中，等. 静电纺丝法制备组织工程纳/微米纤维支架[J]. 自然科学进展,2005, 10(10)：1175-1182