骨唾液酸蛋白与骨形态发生蛋白体内成骨活性的差异*★

王玮1，2，章莹2，吴文2

课题背景：课题为2005广东省科技三项经费计划项目(2005B34001008)。绝大多数矿化组织中的细胞都表达骨唾液酸蛋白，处于骨形成和骨改建中的骨基质骨唾液酸蛋白浓度最高，由此推测可能与骨形成和骨改建有关，本实验主要观察骨唾液酸蛋白在大鼠体内的成骨活性并与骨形态发生蛋白对比，以考察骨唾液酸蛋白的成骨活性。

应用要点：实验通过对骨唾液酸蛋白与骨形态发生蛋白体内成骨活性的对比观察，得出在大鼠颅骨缺损模型中骨唾液酸蛋白具有成骨效应，但其成骨效应较骨形态发生蛋白弱的结论。

术语解析：骨唾液酸蛋白由Fisher等在1983年首先从牛骨中纯化并描述，它是一种酸性磷酸化糖蛋白，在骨组织非胶原蛋白中占10%～15%，其基因位于4号染色体上，核心蛋白Mr为33 600，相对于其他非胶原蛋白，骨唾液酸蛋白有着高度的组织分布特异性，其主要分布于钙化的骨、牙组织及钙化的软骨与骨交界处。

1广州医学院，广东省广州市 510010； 2解放军广州军区广州总医院骨科，广东省广州市
510010

王玮★，男，1982年生，江西省德兴市人，汉族，2007年广州医学院毕业，硕士，医师，主要从事骨组织工程的研究。
myemail306@
tom.com

通讯作者：章莹，博士，副主任医师，解放军广州军区广州总医院骨科，广东省广州市 510010
zhangying-doc@
yahoo.com.cn

摘要
目的: 研究证明，骨唾液酸蛋白可能与骨形成和骨改建有关。实验拟评价骨唾液酸蛋白在大鼠体内的成骨活性并与骨形态发生蛋白相对比。
方法：实验于2006-12/2007-04在解放军广州军区广州总医院动物实验中心完成。①实验分组：8周龄雄性SD大鼠24只，随机数字表法分为骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物组，骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物组，β-磷酸三钙组，空白对照组，每组6只。②实验方法：应用重组人骨唾液酸蛋白及骨形态发生蛋白2分别与β-磷酸三钙复合并植入直径8 mm 的大鼠颅骨骨缺损内。其中骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物组植入骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物，骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物组植入骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物，β-磷酸三钙只植入β-磷酸三钙，空白对照组未植入任何材料。③实验评估：术后8周取出标本，行大体、Ｘ射线、组织学观察及各种植入物的碱性磷酸酶活性。
结果：纳入大鼠24只，均进入结果分析，各组植入物未完全吸收，周围均未见明显炎症反应。①骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物和骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物在大鼠颅骨骨缺损内形成新骨，与宿主骨相连接，但骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物组的成骨量、新骨密度、骨组织成熟程度均较骨形态发生蛋白低。②颅骨缺损植入物中骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物组和骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物组的碱性磷酸酶活性均高于β-磷酸三钙组及空白对照组(P < 0.01)，而骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物组的碱性磷酸酶活性比骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物组高(P < 0.05)。
结论：骨唾液酸蛋白在骨缺损环境中具有成骨效应，与骨形态发生蛋白对比，骨唾液酸蛋白成骨效应较弱。
关键词：骨唾液酸蛋白；骨形态发生蛋白；骨再生；成骨活性；组织构建

王玮，章莹，吴文.骨唾液酸蛋白与骨形态发生蛋白体内成骨活性的差异[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(7):1201-1204 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1201(ps).pdf]

中图分类号: R336
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)07-01201-04

Osteogenic activities of bone sialoprotein versus bone morphogenetic protein in vivo

AIM:Many studies have demonstrated that bone sialoprotein (BSP) may have correlation with bone formation and rebuilding. This study assessed the osteogenic activity of BSP in vivo, and compare with bone morphogenetic protein (BMP).
METHODS: The experiment was performed in the Animal Experimental Center, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Area Command of Chinese PLA from December 2006 to April 2007. ①Twenty-four 8-week-old male SD rats were randomly divided into BSP-β-tricalcium phosphate (β-TCP) group, BMP-β-TCP group, β-TCP alone group and blank control group with 6 animals in each group. ②Recombinate human bone sialoprotein (rhBSP) or recombinate human BMP combined with β-TCP were implanted into the calvarial defects (diameter, 8 mm) in rats, respectively. The β-TCP group was only implanted with β-TCP into the same sites, and nothing was implanted into the blank control group. ③The implants were harvested at 8 weeks after implantation. Alkaline phosphatase (ALP) activity of the implants was evaluated by radiological, histological, and biochemical examinations.
RESULTS: Twenty-four rats were all included in the final analysis. The graft in each group was not absorbed completely, and no apparent inflammatory reaction was found. ①In BSP-β-TCP and BMP-β-TCP groups, new bone formed in the calvarial defects of rats, and the new bone was linking to host bone, but the bone formation mass, density of new bone and maturity degree of bone tissue in BSP-β-TCP were all lower than BMP group. ②The ALP activity in BSP-β-TCP and BMP-β-TCP group was significantly higher than β-TCP group and blank group (P < 0.01), and the ALP activity in BMP-β-TCP group was remarkably higher than BSP-β-TCP group (P < 0.05).
CONCLUSION: BSP shows evident osteogenic effect in the model of bone defects, but its effect is inferior compared to the proved bone growth factor-BMP.

Wang W, Zhang Y, Wu W.Osteogenic activities of bone sialoprotein versus bone morphogenetic protein in vivo.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(7):1201-1204(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1201(ps).pdf]

骨唾液酸蛋白由Fisher等[1]在1983年首先从牛骨中纯化并描述，它是一种酸性磷酸化糖蛋白，在骨组织非胶原蛋白中占10%~15%，其基因位于4号染色体上，核心蛋白Mr为33 600，相对于其他非胶原蛋白，骨唾液酸蛋白有着高度的组织分布特异性，其主要分布于钙化的骨、牙组织及钙化的软骨与骨交界处。骨唾液酸蛋白的功能现在还未完全清楚，绝大多数矿化组织中的细胞都表达骨唾液酸蛋白，处于骨形成和骨改建中的骨基质骨唾液酸蛋白浓度最高[2-3]，由此推测可能与骨形成和骨改建有关，并将其作为一种新的骨生长因子进行研究，本实验主要观察骨唾液酸蛋白在大鼠体内的成骨活性并与经典的骨生长因子骨形态发生蛋白对比，以考察骨唾液酸蛋白的成骨活性。

设计：随机对照动物实验。
单位：解放军广州军区广州总医院动物实验中心。
材料：实验于2006-12/2007-04在解放军广州军区广州总医院动物实验中心完成。8周龄雄性SD大鼠24只，由南方医科大学动物实验中心提供（动物合格证号：0024098）。随机数字表法分为骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物组，骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物组，β-磷酸三钙组，空白对照组，每组6只。
试剂：重组人骨唾液酸蛋白（解放军广州军区广州总医院医学实验科制备）[4]；重组人骨形态发生蛋白2冻干粉(广州市达晖生物技术有限公司)，经小鼠肌袋植入实验，证实有诱导成骨活性；β-磷酸三钙（SYNTHES公司），以β-磷酸三钙为基础的合成，孔隙率60%，孔径100~500 μm，已用于临床，切割成50 mg/块备用；碱性磷酸酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者，干预实施及评估为第一作者。经过正规培训，采用盲法评估。
方法：
骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物的制备[4-5]：取0.79 g/L 的骨唾液酸蛋白溶液均匀滴在β-磷酸三钙表面，完全吸附后置低温负压抽干后使每块β-磷酸三钙（50 mg/块）含骨唾液酸蛋白为2 mg，用环氧乙烷气体消毒，37 ℃、3 h 后置低温密闭保存备用。
骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物的制备[6-7]：取重组骨形态发生蛋白2冻干粉15 mg，溶解于50 mL 浓度为4 mol/L 的盐酸胍溶液中，将β-磷酸三钙颗粒倒入其中，低温负压抽干，使每块β-磷酸三钙颗粒（50 mg/块）含2 mg 重组骨形态发生蛋白2。再用双蒸馏水透析72 h，置低温负压抽干后，用环氧乙烷气体消毒，37 ℃、3 h 后置低温密闭保存备用。
模型制备：所有大鼠麻醉后，手术部位脱毛消毒。在颅顶做一纵行切口，暴露颅盖骨并切除局部骨膜。用环钻造成直径8 mm 的圆形全层顶骨缺损。生理盐水冲洗骨缺损部位以去除残存骨屑。将不同植入物分别植入颅骨缺损部位内，其中骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物组植入骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物，骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物组植入骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物，β-磷酸三钙组只植入β-磷酸三钙，空白对照组未植入任何材料。伤口间断缝合，术后8周麻醉并处死动物，取出植入物周围组织作相关检查。
骨唾液酸蛋白体内成骨活性的观察：①大体观察：植入物周围的组织反应、新生骨形成等。②X射线检查：将实验动物麻醉处死后单独取下大鼠颅骨标本，所有标本均采用同一摄片条件，以比较不同植入物的骨缺损部位新骨形成情况。③组织学检查：取每个植入物周围组织的一半置于体积分数为0.10的甲醛液中固定后，行脱钙石蜡包埋。石蜡切片用苏木精-伊红染色，显微镜下观察。③碱性磷酸酶活性测定：植入物周围组织的另一半经剔除周围组织(去除宿主骨)后定量，匀浆，4 ℃ 下离心30 min (12 000 r/min)。取上清液用碱性磷酸酶试剂盒测其活性。
主要观察指标：①大体观察植入物周围的组织反应及新生骨形成情况。②X射线观查不同植入物的骨缺损部位新骨形成情况。③苏木精-伊红染色观察各组标本新骨形成情况。④各组碱性磷酸酶活性。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0软件完成统计处理，所有结果用_x±s表示，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析纳入大鼠24只，均进入结果分析，无脱落。各组植入物未完全吸收，周围均未见明显炎症反应。
2.2 大体观察植入物周围的组织反应及新生骨形成情况骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物组颅骨缺损部位有一定量钳夹硬度较大的组织形成，但硬度低于周围骨床和骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物组，且密度不均；骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物组颅骨缺损部位可见大量明显硬度较大的组织与宿主骨相连，部分区域硬度与骨床相似，肉眼可见明显骨融合迹象，并填充颅骨缺损；β-磷酸三钙组及空白对照组仅缺损边缘见少量新生骨组织，缺损中心未见明显骨化组织，骨缺损处有纤维组织增生，大部分为纤维组织膜充填。
2.3 X射线检查不同植入物的骨缺损部位新骨形成情况骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物组（见图1a）在颅骨缺损部位有一定量的X射线不透性物质，密度不均匀，阻射密度明显低于周围骨床，且低于骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物组，部分与宿主骨相连，而骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物组（见图1b）颅骨缺损部位有大量的X射线不透性物质，密度接近邻近骨床，直径8 mm 的缺损几乎完全被骨化组织所修复且新生骨与缺损边缘相连。β-磷酸三钙组（见图1c）及空白对照组（见图1d）的颅骨缺损中央区为透光影像，无高密度组织形成。

2.4 组织学检查各组标本新骨形成情况骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物组植入颅骨缺损的骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙已部分吸收，骨缺损区新骨形成明显，并可见骨细胞、骨髓，为板层骨样结构，软骨样结构已消失，见图2。骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物组植入颅骨缺损的骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙部分吸收，骨缺损区新骨形成更为明显，并可见许多板层骨样结构，无软骨样结构，见图3。β-磷酸三钙组骨缺损部位边缘被纤维组织所填充，未见明显成骨细胞及破骨细胞活动。空白对照组骨缺损部位被纤维结缔组织所填充，未见明显成骨活动。

2.5 术后8周各种植入物的碱性磷酸酶活性见表1。
颅骨缺损植入物中骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物组和骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物组的碱性磷酸酶活性高于β-磷酸三钙组及空白对照组，差异有非常显著性意义(P < 0.01)；而骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物组的碱性磷酸酶活性比骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物组高，差异有显著意义 (P < 0.05)。

3.1 骨缺损模型本实验采用的颅骨缺损模型基于Schmitz等[8]的骨极限缺损理论，即指在特定骨骼上所造成的终生不能自行修复并愈合的最小缺损。研究表明大鼠颅骨的极限缺损为8 mm，很多学者均采用此种骨缺损模型[9-12]，颅骨缺损模型不需内固定或外固定，排除了由于骨折端的微动影响骨折愈合的干扰，减少了实验误差。本实验术后8周骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙复合物组和骨形态发生蛋白-β-磷酸三钙复合物组骨缺损基本愈合，而β-磷酸三钙组及空白对照组仅在骨缺损边缘有少量骨组织再生且缺损中心无骨组织生长，说明由于骨生长因子的作用缺损才得以修复。
3.2 生长因子和载体本实验采用的骨唾液酸蛋白由解放军广州军区广州总医院医学实验科提供，王捷等[13]将人骨唾液酸蛋白基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαＡ上，以融合蛋白形式表达重组人的骨唾液酸蛋白，获得的重组人骨唾液酸蛋白纯度高、成分单一、成本大大降低，减少了提纯骨唾液酸蛋白可能混入其他骨生长因子产生的误差。β-磷酸三钙是一种经典的骨缺损替代充填材料，具有良好的骨结合性、降解性和骨传导性，而且吸收后可以为新生骨所替代[14-18]。本实验采用的β-磷酸三钙术后8周已几乎完全吸收，其孔隙率60%，孔径100~500 μm，可作为一种较好的组织工程骨支架材料。
3.3 骨唾液酸蛋白的成骨实验、相关机制及骨唾液酸蛋白的成骨效应 Wang等[19]在1998年首先报道了骨唾液酸蛋白-胶原复合物在大鼠颅骨缺损模型中的成骨作用，骨唾液酸蛋白在骨缺损模型中的成骨作用逐渐引起人们的重视。O’Toole等[5]曾将骨唾液酸蛋白作为金属植入物的涂层，进行了大鼠股骨的植入实验，结果也证明骨唾液酸蛋白具有良好的骨诱导性。王金熙等[4]也证实了骨唾液酸蛋白在大鼠体内的成骨活性。本实验结果显示骨唾液酸蛋白虽然在骨缺损部位表现出成骨活性并能诱导出成熟的骨组织，但在相同的剂量下成骨活性较骨形态发生蛋白为低，其原因可能为骨唾液酸蛋白在组织钙化中表现为双重调节作用[20]，一方面能促进羟基磷灰石聚集形成晶核，另一方面它又能吸附于羟基磷灰石晶体表面而表现出抑制羟基磷灰石晶体生长的特性，可能正因为骨唾液酸蛋白在组织钙化中这种自相矛盾的作用导致较大剂量时成骨效应弱于骨形态发生蛋白。
本实验证实了骨唾液酸蛋白在骨缺损内成骨活性并与骨形态发生蛋白对比，由于成骨机制有所不同，相同剂量下骨唾液酸蛋白成骨效力较骨形态发生蛋白弱，在组织工程骨作为骨科研究热点的今天，骨唾液酸蛋白作为一种新型的骨生长因子仍需进一步研究，因成骨机制尚不完全清楚，需进一步实验来确认。

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