小鼠心肌转化生长因子β1表达与依普利酮的影响☆

张清芬1，2，齐晓勇1，陈淑霞2，吕研琨2

课题背景：醛固酮受体拮抗剂可改善心力衰竭、心肌梗死及压力负荷实验动物模型心室重构，因为在上述情况下肾素血管紧张素醛固酮系统被激活。鸟苷酸环化酶偶联受体－A基因敲除小鼠表现为高血压、心室肥厚和纤维化，有实验表明AT1受体拮抗剂和血管紧张素Ⅱ拮抗剂可阻断上述效应，那么依普利酮作为一种新型醛固酮受体拮抗剂其效果如何？

应用要点：①实验利用鸟苷酸环化酶偶联受体-A基因敲除小鼠动物模型观察依普利酮对心室重构的作用，此动物模型科学可靠，使实验结果可信度提高，目前还未见类似研究报道。②将肼苯哒嗪设立为对照组，从侧面旁证依普利酮独立于血压对心室重构的作用，实验数据清晰明了，易于理解。③从基因学角度探讨重构相关基因的表达。

偏倚或不足：①样本量较小，数据易出现偏倚；另外，给药方式不能保证每只小鼠用药完全一致，有可能出现偏倚现象。②因为醛固酮既可作用于上皮，又可作用于非上皮组织，如果引入一组利尿剂阿米洛利作参照，或许可进一步明确依普利酮作用是否非上皮组织作用的结果。

1河北医科大学，河北省石家庄市 050011；2河北省人民医院心脏中心，河北省石家庄市 050051

张清芬☆，女，1965年生，河北省任丘市人，汉族，河北医科大学在读博士，副主任医师，主要从事心血管病防治方面的研究。
zarazhang@hotmail.
com

通讯作者：齐晓勇，博士，博士研究生导师，主任医师，河北医科大学，河北省石家庄市
050051 xiaoyong_Q@
Yahoo.com

摘要
目的:观察高选择性醛固酮受体拮抗剂依普利酮对鸟苷酸环化酶偶联受体-A基因敲除小鼠心肌转化生长因子β1表达的影响，并对其逆转心室重构的分子机制进行探讨。
方法：实验于2005-06/2006-04 在河北省人民医院心内科、日本奈良县立医科大学第一内科完成。①实验材料：鸟苷酸环化酶偶联受体-A基因敲除小鼠20只由日本国立循环器病中心岸本一郎教授馈赠，雄性，12周龄，基因背景为清洁级C57BL/6小鼠，随机数字表法分为空白对照组6只、依普利酮组7只、肼苯哒嗪组7只。另取同龄野生型小鼠7只作为野生组。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：依普利酮组每天通过饲料给予100 mg/kg依普利酮，肼苯哒嗪组每天通过饮用水给予10 mg/kg肼苯哒嗪，均给药4周。空白对照组与野生组不进行任何干预。③实验评估：每周检测小鼠尾动脉收缩压及体质量。各组小鼠于16周龄时采用腹主动脉抽血法处死，称取心脏重量，计算心脏重量与体质量的比值。心脏切片行Masson三色染色，并利用图像分析系统测量心肌胶原容积分数、心肌血管周围胶原面积和管腔面积之比。实时定量PCR法检测心室胶原纤维Ⅰ、胶原纤维Ⅲ 、心肌转化生长因子β1 mRNA在心肌组织的表达。
结果：①心室重构指标检测：与野生组比较，空白对照组收缩压、心脏重量/体质量、心肌胶原容积分数、心肌血管周围胶原面积/管腔面积均显著升高（P < 0.01）。与空白对照组比较，依普利酮组上述4项指标均显著下降（P < 0.05或0.01）；肼苯哒嗪组收缩压明显下降（P < 0.01），心脏重量/体质量、心肌胶原容积分数、心肌血管周围胶原面积/管腔面积则明显升高（P < 0.05）。②心肌纤维化情况：与空白对照组比较，依普利酮治疗4周后小鼠心肌纤维化得到改善，心脏重量/体质量、心肌胶原容积分数、心肌血管周围胶原面积/管腔面积3项量化指标均降低；肼苯哒嗪治疗４周后表现为心肌纤维化加重，3项量化指标相应增加。③心肌胶原纤维Ⅰ、胶原纤维Ⅲ及心肌转化生长因子β1 mRNA的表达：与空白对照组比较，依普利酮治疗4周后小鼠胶原纤维Ⅰ、胶原纤维Ⅲ及心肌转化生长因子β1的mRNA表达均下降；肼苯哒嗪治疗4周后三者mRNA的表达均升高。
结论：依普利酮可独立于血压改善小鼠心肌纤维化和心室重构，其作用机制可能与抑制心室肌高表达的心肌转化生长因子β1有关。
关键词：心肌转化生长因子β1；心室重构；鸟苷酸环化酶偶联受体A；依普利酮；组织构建

张清芬，齐晓勇，陈淑霞，吕研琨.小鼠心肌转化生长因子β1表达与依普利酮的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(7):1213-1216 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1213(ps).pdf]

中图分类号:R392.114
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)07-01213-04

Effect of eplerenone on myocardial transforming growth factor-beta1 expression in mice

AIM:To investigate the effects of high selective mineralocorticoid receptor (MR) antagonist eplerenone on the expression of transforming growth factor-beta1 (TGFβ1) in myocardium of guanyl cyclase-A (GC-A) knockout mice and to explore its molecular mechanism for reversing left ventricular remodeling.
METHODS: The experiment was conducted in the Department of Cardiology, Hebei Provincial People's Hospital and the First Department of Internal Medicine, Nara Medical University, Japan between June 2005 and April 2006. ①Twenty 12-week-old male GC-A knockout (KO) mice (clean C57BL/6) were gifts from Kishimoto I in National Cardiovascular Center of Japan. They were randomly divided into blank control group (n =6), eplerenone group (n =7) and hydralazine group (n =7). Meanwhile, 7 wild mice with the same genetic background were selected as wild group. The disposition of all animals was accorded with the animal ethics standards during the experiments. ②Eplerenone was given in food to the mice in eplerenone group (100 mg/kg/day) and hydralazine was given in drinking water (10 mg/ kg/day) for four weeks. No intervention was given to the control group and wild group. ③The tail artery systolic blood pressure (SBP) and body mass of mice were measured every week. The mice were executed by exsanguinated through abdominal aorta at 16 weeks. The ratios of the heart weight to the body mass (HW/BM) were calculated. Myocardial tissues were stained with Masson's Trichrome; The collagen volume fraction (CVF) and the ratio of perivascular collagen area (PVCA) to lumen area were measured with image analysis system. The mRNA expression of collagenⅠ, collagenⅢ and TGF-β1 in myocardium were evaluated by real-time quantitative PCR technique.
RESULTS: ①Indexes of ventricular remodeling: Compared with wild group, the SBP, HW/BM, CVF and PVCA were significantly higher in control group (P < 0.01). Compared with control group, the 4 indicators were all decreased significantly in eplerenone group (P < 0.05 or 0.01); The SBP was significantly decreased (P < 0.01), but the HW/BM, CVF and PVCA were obviously higher in hydralazine group (P < 0.05). ②Compared with control group, the cardiac fibrosis was attenuated after 4 weeks of eplerenone treatment, and the three indexes of HW/BM, CVF and PVCA were all lower; But cardiac fibrosis was aggravated after 4 weeks of hydralazine treatment, and those three indexes were all increased. ③Compared with control group, the mRNA expression of collagen Ⅰ, collagen Ⅲ and TGF-β1 were all decreased after 4 weeks of eplerenone treatment; But they were all increased after 4 weeks of hydralazine treatment.
CONCLUSION: Eplerenone improves cardiac fibrosis and ventricular remodeling in GC-A-KO mice by suppressing the expression of TGFβ1 in myocardial tissue.

Zhang QF, Qi XY, Chen SX, Lü YK．Effect of eplerenone on myocardial transforming growth factor-beta1 expression in mice.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(7):1213-1216(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1213(ps).pdf]

心室重构指心脏在负荷或受损状态下某些基因组的表达异常导致心脏分子、细胞及间质变化，临床表现为心脏大小、形态及功能改变，是心衰发生和恶化的重要原因。基础和临床研究显示神经内分泌激活在心室重构的发生发展过程中具有重要作用，近年研究证实醛固酮受体拮抗剂可改善心力衰竭患者心室重构，降低其病死率。
依普利酮为一种新型口服高选择性盐皮质激素受体拮抗剂，通过竞争性抑制醛固酮与盐皮质激素受体结合而发挥降压的作用。
本实验拟利用鸟苷酸环化酶偶联受体-A基因敲除小鼠动物模型检测其对心室重构的作用，并对其相关分子机制进行探讨。�

设计：分组对照，动物观察实验。
单位：河北省人民医院心脏中心。
材料：实验于2005-06/2006-04在河北省人民医院心内科、日本奈良县立医科大学第一内科完成。①动物：GC-A基因敲除小鼠20只（由日本国立循环器病中心岸本一郎教授馈赠，经基因型鉴定确认，无动物质量合格证号），雄性，12周龄，基因背景为清洁级C57BL/6，随机数字表法分为空白对照组6只、依普利酮组7只、肼苯哒嗪组7只。另取同龄野生型小鼠7只作为野生组，由杂合型小鼠与GC-A基因敲除小鼠交配后产生。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②鼠尾动脉血压测定仪（日本Softron Co Ltd公司）；TRIZOL（美国invitrogen公司）；一步法RNA反应试剂盒（日本TaKaRa公司）；KS400图像分析系统（德国Zeiss公司）；Lightwave紫外分光光度计（英国WPA公司）；引物（日本TaKaRa公司）；依普利酮（美国Pfizer Inc公司）；肼苯哒嗪（日本汽巴-嘉基公司）。
设计、实施、评估者：实验设计和结果评估为第二作者，干预实施为第一、三作者，均受过专业培训，未使用盲法评估。
方法：
给药干预：依普利酮组每天通过饲料给予100 mg/kg依普利酮，此平均给药剂量是根据每日饲料总消耗量除以小鼠总体质量得出；肼苯哒嗪组每天通过饮用水给予10 mg/kg 肼苯哒嗪，此平均给药剂量是根据每日总饮水量除以小鼠总体质量得出，均给药4周。空白对照组与野生组不进行任何干预。
血压和体质量测定：每周采用鼠尾动脉血压测定仪检测小鼠清醒状态下的尾动脉收缩压，每周测体质量1 次，取平均值。
心肌标本的获取：各组小鼠于16周龄时采用腹主动脉抽血法处死，快速切除心脏并在冷磷酸盐缓冲液中清洗，称取心脏重量，计算心脏重量与体质量的比值，单位mg/g。心脏从心底至心尖部横向切割成3部分，中段部分置于40 g/L 甲醛溶液中，用于制作组织切片；心尖部分快速置于液态氮中，然后储存于-80 ℃ 冷冻箱，用于mRNA分析。
组织学分析：对固定心脏中段心肌组织进行常规包埋和制片，行Masson三色染色。心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色。利用KS400图像分析系统测量心肌胶原容积分数、心肌血管周围胶原面积和管腔面积之比。心肌胶原容积分数=心肌胶原纤维面积/所测视野面积，心肌血管周围胶原面积和管腔面积之比=小动脉管腔周围胶原纤维面积/管腔面积。每组随机取3张切片，每张心肌切片标本均随机取20个视野进行测量，计算平均值。
实时定量PCR法：①总RNA的提取：将冷冻的心肌组织50 mg 置于匀浆器中匀浆，采用TRIZOL法常规提取总RNA。用RNA紫外分光光度计检测吸光度，以A260/ A280来判断纯度。②反转录聚合酶反应：采用一步法RNA反应试剂盒进行反转录，严格按说明书要求操作。③实时定量PCR反应：反应体系25 μL。以管家基因GAPDH扩增产量为内参照，对样品模板用量标准化。引物序列：胶原纤维Ⅰ上游引物为5’-TCC CGT CTT TGG GGG TTG-3’，下游引物为5’-CCA AAG AAG ACA TCC CTG AAG-3’；胶原纤维Ⅲ上游引物为5’-CTG　GGG CAC CAG - GAG AAC-3’，下游引物为5’-CCA AGA AGA CAT CCC TGA AG-3’；心肌转化生长因子β1上游引物为5’-GCA GCT GTA CAT TGA CTT TAG-3’，下游引物为5’-CAA GGA CCT TGC TGC TGC TGT ATA- CTG -3’。PCR反应条件：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，以上为1个循环，共循环45次。
主要观察指标：①心室重构指标检测。②心肌纤维化情况。③心肌胶原纤维Ⅰ、胶原纤维Ⅲ及心肌转化生长因子β1 mRNA的表达。
统计学方法：由第一作者应用SPSS 11.5软件进行单因素方差分析，所有数据均以_x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 各组小鼠心室重构指标检测与野生组比较，空白对照组收缩压、心脏重量/体质量、心肌胶原容积分数、心肌血管周围胶原面积/管腔面积均显著升高（P < 0.01）。
与空白对照组比较，依普利酮组上述4项指标均显著下降（P < 0.05或0.01）；肼苯哒嗪组收缩压明显下降（P < 0.01），心脏重量/体质量、心肌胶原容积分数、心肌血管周围胶原面积/管腔面积均明显升高（P < 0.05）。见表1。

2.2 各组小鼠心肌纤维化情况与野生组比较，GC-A基因敲除的各组小鼠表现为明显心肌纤维化，且心脏重量/体质量、心肌胶原容积分数、心肌血管周围胶原面积/管腔面积均有所升高。
与空白对照组比较，依普利酮治疗4周后小鼠心肌纤维化得到改善，心脏重量/体质量、心肌胶原容积分数、心肌血管周围胶原面积/管腔面积3项量化指标均降低；肼苯哒嗪治疗4周后表现为心肌纤维化加重，3项量化指标相应增加。见图1。

2.3 各组小鼠心肌胶原纤维Ⅰ、胶原纤维Ⅲ及心肌转化生长因子β1 mRNA的表达与野生组比较，GC-A基因敲除的各组小鼠胶原纤维Ⅰ、胶原纤维Ⅲ及心肌转化生长因子β1 mRNA的表达均明显升高（P < 0.05或0.01）。
与空白对照组比较，依普利酮治疗4周后小鼠胶原纤维Ⅰ、胶原纤维Ⅲ及心肌转化生长因子β1的mRNA表达均下降；肼苯哒嗪治疗4周后三者mRNA的表达均升高，这与组织学检测结果是一致的。见图2。

利钠肽由三种肽组成：心钠肽、脑或B-型尿钠肽、C-型利钠肽。心钠肽在心房合成，脑或B-型尿钠肽在心室合成。利钠肽受体-A和利钠肽受体-B是通过鸟苷酸环化酶介导，他们利用鸟苷酸环化酶作为细胞内信使[1]。心钠肽、脑或B-型尿钠肽更易与利钠肽受体-A结合，利钠肽受体-A又称为鸟苷酸环化酶偶联受体-A。鸟苷酸环化酶偶联受体-A作为心钠素和脑钠素的受体，可在心肌细胞[2]和纤维原细胞表达[3]。最近研究表明心钠肽和脑钠肽不仅作为循环激素，而且可作为自分泌和/或旁分泌局部因子，通过作用于鸟苷酸环化酶偶联受体-A发挥抗心肌肥厚和抗纤维化作用[4]。鸟苷酸环化酶偶联受体-A基因敲除小鼠表现为高血压、心室肥厚和纤维化[5-6]，本实验结果与此是一致的。
研究发现肾素血管紧张素醛固酮系统组成成分存在于心脏组织中[7-8]。醛固酮可引起心肌及血管周围纤维化、阻断心肌去甲肾上腺素摄取、增加血浆纤溶酶原激活物抑制物水平[9-10]，在心室重构中具有重要作用，已成为治疗干预的靶目标。两个大型随机对照临床研究已证实醛固酮受体拮抗剂用于心力衰竭和急性心肌梗死治疗的有效性[11-12]。近年对高血压[13-14]、心肌梗死[15]、压力负荷[16]动物模型研究也显示了醛固酮受体拮抗剂螺内酯或依普利酮对心脏的保护作用。Li等[17]利用鸟苷酸环化酶偶联受体-A基因敲除小鼠动物模型证实血管紧张素Ⅱ受体AT1阻滞对心室重构的改善作用。本实验中高选择性盐皮质激素受体拮抗剂依普利酮不仅降低鸟苷酸环化酶偶联受体-A基因敲除小鼠的血压，并可通过降低心肌胶原纤维的表达，改善心室肥厚和纤维化；而肼苯哒嗪尽管对鸟苷酸环化酶偶联受体-A基因敲除小鼠具有相似的降压作用，但鸟苷酸环化酶偶联受体-A基因敲除小鼠心肌肥厚和心室纤维化加重，这表明依普利酮可独立于血压改善心肌肥厚和心室纤维化。
Nagata等[18]报道依普利酮可改善Dahl-盐敏感大鼠心室肥厚，并使其心肌11β-羟基类固醇脱氢酶1基因表达下调，而这种大鼠的血浆醛固酮处于低水平。此研究提示在低肾素、低醛固酮情况下，糖皮质激素介导的盐皮质激素受体激活促进心脏及血管周炎症的发生，而依普利酮的有益作用似乎至少部分源于糖皮质激素-盐皮质激素受体激活诱导的氧化应激和炎性效应降低。本实验中肼苯哒嗪组鸟苷酸环化酶偶联受体-A基因敲除小鼠心肌肥厚和纤维化明显加重，可能是由于交感神经和肾素血管紧张素系统激活所致。
转化生长因子β是一种局部产生的与各种组织器官的纤维化有关的细胞因子，通过旁分泌或自分泌的方式可刺激成纤维细胞的增生、ECM的沉积及心肌细胞的肥大。它与肾素血管紧张素醛固酮系统在纤维化发生发展过程中联系复杂，相互关联，血管紧张素Ⅱ和醛固酮可分别通过作用于转化生长因子β引起心肌损害[19-21]。转化生长因子β1促进心肌成纤维细胞表达胶原纤维Ⅰ和胶原纤维Ⅲ[22]，本实验中依普利酮组胶原纤维Ⅰ和胶原纤维Ⅲ的表达降低，与此相一致，转化生长因子β1表达低下，而肼苯哒嗪具有相反作用，这表明醛固酮对鸟苷酸环化酶偶联受体-A基因敲除小鼠心肌纤维化的作用可能是由转化生长因子β1介导的。

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