胰岛素样生长因子Ⅰ抑制氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的

胰岛素样生长因子Ⅰ抑制氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的
体外试验*☆

米少华，卢永昕，刘启云，高焱章

课题背景：课题由国家自然科学基金资助(30470457)。胰岛素样生长因子Ⅰ水平在冠心病患者中水平明显低于正常人群，而有研究证实高血压、高脂血症时均与胰岛素样生长因子Ⅰ的异常有关，提示胰岛素样生长因子Ⅰ可能参与动脉粥样硬化的发展。

应用要点：①实验观察到胰岛素样生长因子Ⅰ可以抑制由氧化低密度脂蛋白所诱导的内皮细胞凋亡。②胰岛素样生长因子Ⅰ可以通过下调Caspase-3的活性，抑制氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞产生凋亡。

同行评价：文章观察和探讨胰岛素样生长因子Ⅰ与氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的相互关系，为探讨和阐明防治动脉粥样硬化的机制提供一定的实验依据。

米少华☆，女，1977年生，山东省烟台市人，汉族，华中科技大学附属协和医院在读博士，主治医师，主要从事心力衰竭方面的研究。
msh0520@126.com

通讯作者：卢永昕，博士，主任医师，华中科技大学附属协和医院心内科, 湖北省武汉市 430022

摘要
目的:胰岛素样生长因子Ⅰ作为重要的促细胞生长因子之一，其对内皮细胞凋亡影响的报道不多。实验拟验证和探讨胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用及可能机制。
方法：实验于2006-12/2007-07在华中科技大学同济医学院协和医院心血管疾病研究所完成。①实验材料及分组处理：取人新鲜脐带（产妇或家属签署知情同意书）分离培养人脐静脉内皮细胞,分为: 胰岛素样生长因子Ⅰ组(1×10-9 mmol/L)、氧化型低密度脂蛋白(200 mg/L)+胰岛素样生长因子Ⅰ组(1×10-9 mmol/L)、氧化型低密度脂蛋白(200 mg/L)组、正常对照组。分别在细胞培养24 h后加入。②实验评估：采用四甲基偶氮唑盐法测定细胞活力；DAPI细胞核荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化及细胞凋亡率的测定；并进行内皮细胞 caspase-3活性的检测。
结果：①氧化型低密度脂蛋白可明显抑制人脐静脉内皮细胞增殖，胰岛素样生长因子Ⅰ与氧化型低密度脂蛋白共同加入后，细胞增殖率明显上升（P < 0.05）。②氧化型低密度脂蛋白可诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡，而加入胰岛素样生长因子Ⅰ刺激后细胞凋亡率降低（P < 0.05）。③caspase-3活性检测表明与对照组相比，氧化型低密度脂蛋白能明显上调caspase-3的表达，而胰岛素样生长因子Ⅰ+氧化型低密度脂蛋白组caspase-3活性则降低（P < 0.05）。
结论：胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡具有抑制作用，可能与其下调caspase-3蛋白表达有关。
关键词: 胰岛素样生长因子Ⅰ；内皮细胞；细胞凋亡；组织构建

米少华，卢永昕，刘启云，高焱章．胰岛素样生长因子Ⅰ抑制氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的体外试验[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(7):1217-1220 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1217(ps).pdf]

中图分类号:R392.114
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)07-01217-04

Insulin-like growth factor Ⅰ inhibits oxidized lipoprotein-induced apoptosis of human umbilical vein endothelial cells in vitro

AIM:As a factor that can improve cell growth, there are few studies about the effect of insulin-like growth factor Ⅰ (IGF-Ⅰ) on the apoptosis of endothelial cell. The study investigated the inhibition and mechanism of IGF-Ⅰ on the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) induced by oxidized low density lipoprotein (ox-LDL).
METHODS: The experiment was performed in the Institute of Cardiovascular Disease, Union Hospital of Huazhong University of Science and Technology from December 2006 to July 2007. ①Fresh human umbilical cord was obtained (the informed consent) to isolate and culture HUVECs. The cells were divided into four groups. Except the control group, HUVEC cells were cultured with IGF-Ⅰ(1×10–9mmol/L), ox-LDL (200 mg/L)+IGF-Ⅰ(1×10–9mmol/L), and ox-LDL (200 mg/L), respectively after cultured for 24 hours. ②Cell viability was determined by MTT assay, morphology and apoptosis by DAPI fluorescence staining, and expressions of caspase-3 were analyzed.
RESULTS: ①Ox-LDL could significantly inhibit HUVEC cell proliferation. After treated with both IGF-Ⅰand ox-LDL, the cell proliferation increased obviously compared with the cells treated with ox-LDL (P < 0.05). ②Ox-LDL also induced HUVEC apoptosis, but the awoptosis rate was decreased by IGF-Ⅰ (P < 0.05). ③caspase-3 viability test showed that compared with the normal control, ox-LDL markedly upregulated caspase-3 protein expressions of HUVEC, while IGF-1+ox-LDL treatment decreased caspase-3 protein expression significantly (P < 0.05).
CONCLUSION: IGF-Ⅰ can inhibit the apoptosis of HUVEC induced by ox-LDL through its downregulating effect on the expression of caspase-3 proteins.

Mi SH, Lu YX, Liu QY, Gao YZ.Insulin-like growth factor Ⅰinhibits oxidized lipoprotein-induced apoptosis of human umbilical vein endothelial cells in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(7):1217-1220(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1217(ps).pdf]

内皮细胞凋亡在动脉粥样硬化形成过程中起重要作用,多种影响动脉粥样硬化的因素均影响内皮细胞凋亡。对内皮细胞凋亡的研究将可能为防治动脉粥样硬化提供新的治疗途径。细胞凋亡与氧自由基有关, 氧化低密度脂蛋白作为氧自由基的携带者可以诱导细胞凋亡的发生。许多研究显示氧化低密度脂蛋白在动脉粥样硬化形成早期起重要作用。体外研究已经证明氧化低密度脂蛋白对培养的内皮细胞有细胞毒性。胆固醇氧化物使培养的牛主动脉内皮细胞凋亡增加,氧化低密度脂蛋白使人脐静脉内皮细胞凋亡增加,抗氧化剂明显阻断氧化低密度脂蛋白引起的内皮细胞凋亡[1-2]。近年来的研究发现，胰岛素样生长因子Ⅰ作为重要的促细胞生长与抗细胞凋亡的调节因子之一，与动脉粥样硬化密切相关[3]。但其对内皮细胞的凋亡有无影响，报道不多，本实验从凋亡角度观察胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化低密度脂蛋白致内皮细胞凋亡的作用,探讨其抗动脉粥样硬化的可能机制。

设计：体外实验,分组对照。
单位：华中科技大学同济医学院协和医院心血管疾病研究所。
材料：实验于2006-11/2007-07在华中科技大学同济医学院协和医院心血管疾病研究所学心内实验室完成。脐带来自本院产科,产妇或家属签署知情同意书。胰岛素样生长因子Ⅰ、低密度脂蛋白购自SIGMA； caspase-3 活性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；DMEM、FBS均购自GIBCO。
设计、实施、评估者：实验的设计、实施及评估由全体作者完成，均经过相关培训。
技术路线：
低密度脂蛋白的氧化修饰:参照王拥军等[4]的方法用Cu2+氧化修饰低密度脂蛋白。将氧化后低密度脂蛋白溶液过滤，4 ℃保存备用。
人脐静脉内皮细胞分离培养:取健康产妇分娩后的胎儿脐带, 生理盐水冲洗后,用1 g/L的Ⅱ型胶原酶溶液（含血清的DMEM培养基配制）灌注脐静脉20 min,将人脐静脉内皮细胞消化下来,用含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液洗涤2次,收集灌注液,800 r/min离心6 min,收集所得细胞至25 cm2培养瓶中,待细胞贴壁后，再加入含血清的DMEM培养。内皮细胞经倒置显微镜、Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测鉴定为人脐静脉内皮细胞。取第2，3代细胞用于实验。
实验分组:①胰岛素样生长因子Ⅰ组:加入终浓度为1×10-9 mmol/L的胰岛素样生长因子Ⅰ。②氧化低密度脂蛋白+胰岛素样生长因子Ⅰ组:加入终浓度为1×10–9 mmol/L的胰岛素样生长因子Ⅰ和200 mg/L的氧化低密度脂蛋白。③氧化低密度脂蛋白组:仅加入终浓度为200 mg/L的氧化低密度脂蛋白。④对照组:加入等体积的培养基。
四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性：实验所用细胞调至对数生长期后，2.5 g/L胰蛋白酶消化，并调整浓度为1×109 L–1。取适量接种于96孔培养板。24 h后分别加入氧化低密度脂蛋白与胰岛素样生长因子Ⅰ。48 h后加10 μL四甲基偶氮唑盐，继续培养4 h，弃去培养液，加150 μL二甲基亚砜，570 nm检测吸光度。
细胞形态学观察：取适量接种于预先置有处理过玻片的6孔培养板中。24 h后，分别加入氧化低密度脂蛋白与胰岛素样生长因子Ⅰ。48 h后，取出玻片，DAPI染色，荧光显微镜观察, 取5个高倍镜视野，计数100个细胞中凋亡细胞所占的比例，结果以细胞核凋亡百分率表示。
内皮细胞 caspase-3活性检测：细胞消化后移入6孔板，待细胞密度达至80%左右时，按试验设计分组处理细胞后，参照试剂盒说明书进行caspase-3活性检测。
主要观察指标：细胞生长情况,细胞凋亡形态观察，细胞核凋亡率，caspase-3活性。
统计学方法：由第一作者用SPSS 10.0软件进行独立样本t检验,以P < 0.05判定差异的显著性。

2.1 胰岛素样生长因子Ⅰ对脐血管内皮细胞生长的影响四甲基偶氮唑盐测定结果显示，氧化低密度脂蛋白可明显抑制人脐静脉内皮细胞的生长,加入胰岛素样生长因子后内皮细胞活力增强（0.070±0.004，0.154±0.008，P < 0.05），氧化低密度脂蛋白的作用受到明显抑制。
2.2 胰岛素样生长因子Ⅰ及氧化低密度脂蛋白对内皮细胞凋亡的影响 DAPI染色，镜下观察到对照组荧光形态完整，染色均匀，见图1。氧化低密度脂蛋白组荧光浓缩，形态不规则，见图2。

氧化低密度脂蛋白+胰岛素样生长因子Ⅰ组荧光形态基本正常，偶见异常碎片，见图3。细胞核凋亡百分率显示氧化低密度脂蛋白处理组人脐静脉内皮细胞凋亡率显著高于胰岛素样生长因子Ⅰ组[(17.3±1.21)%,(6.2±0.75)%,P < 0.05],而用胰岛素样生长因子Ⅰ与氧化低密度脂蛋白处理组的细胞凋亡率为(10±0.89)%,显著低于氧化低密度脂蛋白处理组(P < 0.05, n = 6)，见图4。

2.3 胰岛素样生长因子Ⅰ及氧化低密度脂蛋白对caspase-3蛋白表达的影响氧化低密度脂蛋白处理组的caspase-3蛋白活性明显高于胰岛素样生长因子Ⅰ组[(1084.2±254.3) %,(408.6±126.4)%,P < 0.05],而胰岛素样生长因子Ⅰ+氧化低密度脂蛋白处理组caspase-3活性则显著低于氧化低密度脂蛋白处理组[(706.8.2±182.6) %,(408.6±126.4)%,P < 0.05]。

细胞凋亡又称其为程序性细胞死亡[5]，是细胞在一定的生理或病理条件下遵循自身的程序结束生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体被其他细胞吞噬。其在机体的正常发生、组织重建、老化和应答、不可恢复的损害中具有重要意义。凋亡的失控可能成为多种疾病的病因。目前研究发现，内皮细胞凋亡与动脉粥样硬化发生有关。血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生发展的起始因素。血管内皮细胞凋亡增加可以导致内皮更新加快，但由于出生的内皮细胞多存在不同程度的功能缺陷，因而不能提供足够的血管保护功能。凋亡的内皮细胞可诱发血小板聚集，局部血栓形成，引发动脉粥样硬化，因此保护内皮细胞免受损伤是防治动脉粥样硬化的关键。血浆低密度脂蛋白水平与动脉粥样硬化呈负相关,而低密度蛋白脂促进动脉粥样硬化的第一步便是破坏内皮细胞功能,促进其凋亡;此外, 低密度脂蛋白还可以诱导核因子κB表达升高,单核细胞浸润,启动炎症反应。
本文采用培养的人脐静脉内皮细胞作为观察对象，观察氧化低密度脂蛋白对其增殖及凋亡的影响及胰岛素样生长因子Ⅰ的干预作用。实验发现，体外给予氧化低密度脂蛋白刺激后，内皮细胞活性明显低于正常对照组，胰岛素样生长因子Ⅰ组细胞活力明显增强。胰岛素样生长因子Ⅰ+氧化低密度脂蛋白组活性也明显高于单纯氧化低密度脂蛋白组，提示胰岛素样生长因子Ⅰ具有促进细胞增殖的作用并能抑制氧化低密度脂蛋白的效应。DAPI染色后，在荧光显微镜下,正常细胞核DNA显示蓝色均匀荧光,如出现凋亡细胞时,细胞核可致密浓染,甚至见荧光碎片。本实验中观察到正常组及胰岛素样生长因子Ⅰ组未发现凋亡征象。在氧化低密度脂蛋白组，荧光明显浓缩，形状不规则，提示细胞核明显浓缩，荧光碎片提示有可能发生DNA断裂；在氧化低密度脂蛋白组+胰岛素样生长因子Ⅰ组，细胞核形态则基本完整，少见异常浓缩细胞核及荧光碎片；细胞凋亡计数显示,氧化低密度脂蛋白组、胰岛素样生长因子Ⅰ组的凋亡率分别为17.33%，6%，P < 0.05。加入胰岛素样生长因子Ⅰ后,氧化低密度脂蛋白组凋亡率下降至10%。胰岛素样生长因子Ⅰ+氧化低密度脂蛋白组与单纯氧化低密度脂蛋白组比较,存在显著性差异（P < 0.05）；由此推断: 胰岛素样生长因子Ⅰ可能对氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡起到抑制作用。
在细胞凋亡发生和发展过程中，caspase家族起着重要作用。Caspase属于天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶，至今已有10余种家族成员先后被发现，正常时以半胱氨酸前体形式存在。Caspase分为启动分子和效应分子，前者接受死亡的信号启动凋亡或激活下游的分子，后者则裂解细胞蛋白质、骨架、核酸等。半胱氨酸酶的激活存在两条途径：①细胞外途径：细胞死亡受体如Fas受体激活，先激活Caspase-8,再激活下游分子引起凋亡。②细胞内途径：线粒体渗透性增加，细胞色素C和凋亡诱导因子从线粒体中进入胞液，激活Caspase家族成员，启动凋亡发生。不管是细胞内途径还是细胞外途径，最终都将通过Caspase-3实现诱导凋亡的功能。在此蛋白酶级联过程中，Caspase-3处于核心位置，一般来说Caspase-3的活化就意味着凋亡进入了不可逆阶段可能发挥着重要作用，故而也被称为死亡蛋白酶 [6-7]。因此，Caspase-3活性可用于评价细胞蛋白的溶蛋白性裂解，反映细胞凋亡程度。由于其可定量测定，因而更易于反映凋亡的细微差别。本实验通过Caspase-3活性的检测，发现氧化低密度脂蛋白诱导组内皮细胞Caspase-3活性明显高于胰岛素样生长因子Ⅰ组，胰岛素样生长因子Ⅰ处理即可以明显降低内皮细胞内caspas-3蛋白活力,表明氧化低密度脂蛋白的致凋亡效应与Caspase家族蛋白酶激活有关。胰岛素样生长因子Ⅰ可抑制此作用。
近年来的研究表明，血浆胰岛素样生长因子Ⅰ与动脉粥样硬化关系密切。冠心病患者血胰岛素样生长因子Ⅰ水平明显低于正常人[8]。与致命性心脏病呈负相关[9]。低循环胰岛素样生长因子Ⅰ水平的患者血压较高[10]，可以增加心血管疾病的危险，导致心肌梗死发生率增加[11]。有研究发现，血浆胰岛素样生长因子Ⅰ水平对缺血性心脏病的保护作用在校正体质量指数、吸烟、高胆固醇血症、乙醇摄入、运动、年龄、性别、社会、糖尿病家族史、抗高血压药物应用后仍有显著性，这说明低循环胰岛素样生长因子Ⅰ水平是缺血性心脏病的独立危险因素[12]。最新研究则发现APOE基因缺陷大鼠，高脂饮食的同时给予胰岛素样生长因子Ⅰ体内注射，可以延缓动脉粥样硬化斑块的进展，以及血管平滑肌细胞的迁移，白细胞介素6及肿瘤坏死因子α等炎性因子的表达[13]，为防治动脉粥样硬化提供了新的思路。
胰岛素样生长因子Ⅰ可通过多种途径保护血管内皮功能，胰岛素样生长因子Ⅰ可以诱导血管舒张，参与调节血管张力，保存冠脉血流储备[14-15]，可通过促进离子通路开放，减轻缺血再注损伤对内皮造成的损伤[16]；可以刺激内皮细胞一氧化氮合成增多[17]，从而抑制内皮细胞凋亡[18-19]，还可动员血循环内皮祖细胞参与血管内皮的修复[20]，调节血脂异常等直接阻止内皮功能损伤[21]。
如前所述，氧化低密度脂蛋白可通过抑制内皮细胞增殖和诱导凋亡产生致病作用，本实验观察到胰岛素样生长因子Ⅰ可以抑制由氧化低密度脂蛋白所诱导的内皮细胞凋亡，提示胰岛素样生长因子Ⅰ具有直接的内皮细胞保护作用。胰岛素样生长因子Ⅰ可以通过下调Caspase-3的活性，抑制氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞产生凋亡,对内皮细胞起到保护作用，这可能是其防治动脉粥样硬化的机制之一。

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