内皮型一氧化氮合酶基因转染对移植人工血管内膜增生的作用*★

裴斐，李俊彦，张莉，何蕊

课题背景：课题为国家自然科学基金资助项目（30470456），主要进行组织工程人工血管的研究。目前，课题组已将人工血管内皮化，并在内皮细胞种植前先铺种平滑肌细胞，使血管结构更接近生理结构。为了提高血管的抗血栓能力和抑制内膜增生，分别在内皮细胞和平滑肌细胞中转入内皮型一氧化氮合酶和组织型纤溶酶原激活物基因。将转染了基因的细胞作为种子细胞，联合种植在人工血管上，提高人工血管长期通畅率已取得初步的成功。

应用要点：实验采用假型反转录病毒载体进行基因转染，使细胞内基因的转染率更高，持续时间更长，使应用基因修饰人工血管技术最终应用于临床成为可能。在平滑肌细胞中导入内皮型一氧化氮合酶基因，调控平滑肌细胞的增殖，防止内膜增生，从而提高人工血管的长期通畅率。

相关链接：理想的人工血管应该有良好的组织相容性、抗血栓性、物理稳定性、抗感染性和易使用性。为了提高人工血管的血液和组织相容性，人们采用具有很好微孔效应的人造材料，将人造血管内皮化，在人工血管上预衬纤维粘连蛋白或种植平滑肌细胞提高内皮细胞黏附率，利用组织型纤溶酶原激活物、内皮型一氧化氮合酶、lacZ等基因修饰人工血管，增强人工血管的抗血栓和抗内膜增生能力。提高人工血管临床治疗效果的手段多种多样，无论从形态还是功能上，越接近生理血管的人工血管临床效果就越好，未来的研究发展中也得从这个方向出发。

西安交通大学医学院第二附属医院心胸外科，陕西省西安市
710004

裴斐★，男，1964年生，陕西省西安市人，汉族，1986年西安医科大学毕业，硕士，副教授，主要从事生物医学工程和心血管外科学的研究。
zmpf@vip.sina.com

国家自然科学基金资助项目（30470456）*

摘要
目的:平滑肌细胞增殖移行和血小板激活导致血栓形成是移植血管再狭窄的主要原因，一氧化氮可以抑制上述生物反应，但内皮型一氧化氮合酶基因转染是否抑制种植了平滑肌细胞的人工血管内膜增生还未得到证实。实验拟进一步观察内皮型一氧化氮合酶基因转染对种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生的影响。
方法：实验于2006-04/2007-05在西安交通大学医学院中心实验室及分子生物学实验室完成。①实验材料：1月龄新西兰大白兔1只，用来获取平滑肌细胞。成年新西兰大白兔18只，随机数字表法分成3组，每组6只。正常细胞组移植未种植细胞的人工血管；LacZ转染组移植种植转染lacZ的平滑肌细胞的人工血管，内皮型一氧化氮合酶转染组移植种植内皮型一氧化氮合酶的平滑肌细胞的人工血管。②实验方法：构建含有报道基因lacZ和内皮型一氧化氮合酶基因的假型反转录病毒载体小鼠白血病病毒/疱疹性口炎病毒G糖蛋白，并转染平滑肌细胞。将转染了基因的细胞种植在人工血管上，并用血管旁路移植的方法植入兔腹主动脉。③实验评估：测定转染内皮型一氧化氮合酶基因及LacZ基因细胞培养上清中一氧化氮含量。血管植入30，100 d 后X-gal染色及苏木精-伊红染色观察人工血管上的平滑肌细胞，同时显微镜下测量每段血管内膜增生的厚度。
结果：纳入成年新西兰大白兔18只，均进入结果分析。①内皮型一氧化氮合酶转染组一氧化氮含量明显高于未转染的正常细胞组（P < 0.05)。平滑肌细胞转染lacZ基因后经X-gal染色，倒置显微镜下可见转染了基因的细胞被染成蓝色。②血管植入30 d，与正常细胞组比较，LacZ转染组和内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度差异无显著性（P > 0.05）；100 d后，内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度与正常细胞组无明显差异，与LacZ转染组相比较，差异显著（P < 0.05）。
结论：内皮型一氧化氮合酶基因转染抑制了种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生。
关键词：人工血管；平滑肌细胞；转染；内皮型一氧化氮合酶基因；内膜增生；组织工程化血管；组织构建

裴斐，李俊彦，张莉，何蕊. 内皮型一氧化氮合酶基因转染对移植人工血管内膜增生的作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(7):1225-1229 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1225(ps).pdf]

中图分类号:R318.11
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)07-01225-05

Neointimal hyperplasia in the vessel grafts transfected with endothelial nitric oxide synthase gene

AIM:Smooth muscle cells (SMCs) proliferation and transmigration and platelet activation cause thrombogenesis and lead to grafted vessel restenosis. Nitric oxide (NO) can inhibit the above-mentioned biological responses, but whether endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene transfection can inhibit the proliferation of neointimal hyperplasia with grafted SMCs is still uncertain. This study observed the effect of eNOS on neointimal hyperplasia seeded with SMCs.
METHODS: The experiment was performed at the Central Laboratory and Laboratory of Molecular Biology of Xi'an Jiaotong University Medical College from April 2006 to May 2007. ①One 1-month-old New Zealand rabbit was used to acquire SMCs. Another 18 adult New Zealand rabbits were randomly divided into 3 groups (n=6). In normal cell group, the vascular prosthesis with no SMCs were transplanted; in SMC/lacZ group, the vascular prosthesis with SMCs transfected with lacZ were transplanted; in SMC/eNOS group, the vascular prosthesis with SMCs seeded with eNOS were transplanted. ②Rabbit SMCs were transduced with pseudotyped retroviral vectors carrying genes coding for eNOS or lacZ gene. The SMCs then were seeded on the vascular prosthesis and implanted into the rabbit abdominal aorta using vessel bypass transplantation. ③NO content in the supernatant of cells transfected with eNOS and lacZ gene. The grafts were stained with X-gal and HE to visualize the seeded cells after 30 and 100 days of implanted. The thickness of the neointima on a graft was measured with a microscope.
RESULTS: Eighteen rabbits were all included in the final analysis. ①NO content in the SMC/eNOS group was significantly higher than that in the normal cell group (P < 0.05). The SMCs transfected with lacZ gene showed blue after X-gal staining under the inverted microscope. ②Thirty days after implantation, there was no difference in neointimal thickness between normal grafts and grafts seeded with eNOS or lacZ transduced SMCs (P > 0.05). 100 days after implantation, the neointimal thickness on grafts seeded with eNOS transduced SMCs was similar to that of unseeded grafts, but was significantly thinner than those on grafts seeded with SMCs transduced with only lacZ gene (P < 0.05).
CONCLUSION: eNOS gene in the seeded cells inhibits neointimal hyperplasia in the vessel graft seeded with SMCs.

Pei F, Li JY, Zhang L, He R. Neointimal hyperplasia in the vessel grafts transfected with endothelial nitric oxide synthase gene.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(7):1225-1229(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1225(ps).pdf]

血管重建广泛应用于各种血管疾病的治疗。自体血管来源有限，临床上迫切需要各种口径，尤其是直径小于6 mm 的血管替代物作为重建材料。而目前常用的各种血管虽然在代替大、中动脉方面较为成功，但是在用于重建小口径血管（< 6 mm）时，常因腔内血栓形成和吻合口内膜增生而造成管腔堵塞，远期通畅率极低，从而大大限制了临床的应用。血管再狭窄的发生是慢性免疫、炎症反应参与的血栓形成、内膜增生、血管重塑等过程[1-2]。血管平滑肌细胞增殖、迁移及合成大量细胞外基质是血管再狭窄发生的关键[3]。一氧化氮是内皮源性舒张因子，可以抑制血小板聚集和黏附、抑制白细胞黏附和血管平滑肌的增生[4]。但是，一氧化氮的生物半衰期短，供体易耐受和产生其他副作用。本文通过一氧化氮合酶基因转染血管平滑肌细胞恢复一氧化氮的生成，将转染后的细胞种植于人工血管后植入兔子腹主动脉，观察内皮型一氧化氮合酶基因转染对人工血管内膜增生的影响。

设计：重复观察测量。
单位：西安交通大学医学院第二附属医院。
材料：实验于2006-04/2007-05在西安交通大学医学院中心实验室及分子生物学实验室完成。1月龄新西兰兔1只，体质量0.75 kg；清洁级成年新西兰大白兔18只，体质量4.0~4.5 kg，由西安交通大学医学院实验动物中心提供（动物合格证号：陕医动字08-018）。
细胞株和质粒：pCnBgSN是lacZ基因的表达质粒[5]；质粒HIT60是鼠白血病反转录病毒(Murine leukemia virus，MuLV)Gag和Pol蛋白的表达质粒[6]；质粒CVG是疱疹性口炎病毒G糖蛋白(Vesicular stomatitis virus G glycoprotein，VSV-G)的表达质粒[7]；pLCNSN是eNOS基因的表达质粒。所有质粒及人293T细胞、293/GPG包装细胞系均由余红博士馈赠。所有质粒DNA均用试剂盒(Valencia，CA)从大肠杆菌中提取。
主要试剂及仪器：DMEM培养基(Hyclone公司)；小牛血清(杭州四季青生物技术材料研究所)；胰蛋白酶、多聚季胺(polybrene)储用液(8 g/L)(Sigma公司)；G418储用液(50 g/L)(Gibco/BRL)。CO2培养箱(Thermo Heraeus)、无菌超净台、离心机(北京医用离心机厂)；倒置显微镜(上海精密仪器仪表有限公司)。
设计、实施、评估者：实验设计、评估为第一作者，干预实施为全部作者，均经过系统培训，未采用盲法评估。
方法：
兔血管平滑肌细胞的分离和原代培养：在无菌麻醉条件下取1月龄新西兰大白兔胸主动脉及腹主动脉，立即置于含青霉素100 U/mL、链霉素100 g/L 的无菌磷酸盐缓冲液中。超净工作台内，用磷酸盐缓冲液反复冲洗去除血污，获干净光滑的血管段，用眼科镊固定血管段，去除外膜结缔组织，纵剖血管，用镊子钝性刮除内膜层细胞后，剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好，再用含青霉素、链霉素的磷酸盐缓冲液反复冲洗，眼科剪将其剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小的组织块，将组织块转移入培养瓶中，加入DMEM培养液（含体积分数为0.2的胎牛血清），在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。自第2代起即可换成含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液。实验选用3~5代的细胞。
传代细胞成活率的检查：取消化传代的细胞悬液 9 mL，加入1 mL 4 g/L 椎虫蓝液，混匀后吸取1滴于细胞计数器上，倒置相差显微镜下观察，凡是着色细胞均为不正常或者死亡细胞，共计数1 056个细胞，其中42个为阳性，约有96%的细胞染色呈阴性，表明培养的细胞消化传代后成活率较高。
血管平滑肌细胞的鉴定：通过观察血管平滑肌细胞形态和用α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色对培养的细胞进行鉴定。
假型反转录病毒载体的构建和细胞转染：MuLV VSV-G参考3个质粒短暂转染体系[5]方法生产。MuLV/VSV-G/eNOS、MuLV/VSV-G/lacZ用质粒pCVG、pHIT60分别与pLCNSN、pCnBgSN短暂转染293T细胞。产生的病毒颗粒用来转导293/GPG包装细胞系，分别命名为293/GPG/CnBgSN，293/GPG/LCNSN。MuLV/ VSV-G载体的转导效率高达90%，所以转导后的293包装细胞系不用筛选即可作为稳定的病毒生产细胞[7]。293/GPG/CnBgSN，293/GPG/LCNSN细胞达到90%融合后，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，在新鲜的不含四环素的DMEM培养基中培养。每隔24 h 收集病毒上清更换新鲜培养基。用新霉素抗性筛选测得病毒滴度为109~ 1010 cfu/L。收集的病毒上清（直到72 h）用0.45 μm 滤器过滤后用于血管平滑肌细胞的转染。所有种植的细胞均用携带β-gal报告基因lacZ的反转录病毒载体转染。这样可以区别种植细胞和沉积在种植的人工血管上的内源性细胞。被转染的细胞在用X-gal染色后呈现蓝色[8]。种植的细胞分为2组，一组平滑肌细胞除了转染lacZ基因外，还用携带有内皮型一氧化氮合酶基因的反转录病毒载体共转染。第1天将平滑肌细胞以3×104个/孔接种于直径为30 mm 的6孔板中；第2天平滑肌细胞生长至约70%~80%融合后，加病毒上清(VSV-G/MuLV/lacZ) 0.5 mL(含8 mg/L polybrene)，2 h 后，加入1.5 mL 新鲜培养基。第3天，转染平滑肌细胞用磷酸盐缓冲液清洗细胞后，加含体积分数为0.2新生牛血清的DMEM培养液各2 mL，37 ℃ 下培养24 h。用G418方法筛选测得转染效率为90%。共转染时将两种病毒上清混合后按上述方法转染。共转染的转染效率比单基因转染效率低10%。
平滑肌细胞转染内皮型一氧化氮合酶及LacZ基因的测定：分别取转染内皮型一氧化氮合酶、lacZ基因的平滑肌细胞和未转染的平滑肌细胞，用硝酸还原酶法检测一氧化氮浓度来测定内皮型一氧化氮合酶的活性（试剂盒由南京建成生物工程研究所提供）。本试剂盒用硝酸还原酶特异地将NO3-还原为NO2-，NO2-与显色剂作用生成有色物质，通过显色深浅测定其浓度的高低。用X-gal染色法检测β-gal的活性。吸去细胞上清，5 g/L 戊二醛固定细胞后，磷酸盐缓冲液清洗3遍后染色。X-gal染液：l g/L X-gal(gibco BRL)，2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L K3Fe(CN)6和5 mmol/L K4Fe(CN)6的磷酸盐缓冲液， 37 ℃ 过夜后，倒置显微镜下观察。
细胞种植人工血管：用2.5 g/L 胰蛋白酶消化细胞，镜下观察细胞变圆、细胞间隙变大时用Hank’s液终止消化，吸管吹打成细胞悬液。用血浆纤维粘连蛋白(0.1 mg/L，用磷酸盐缓冲溶液配制)预衬人工血管后，内充细胞悬液（3×108 L-1），两端加热封闭。在37 ℃ 以1 r/min 的转速旋转人工血管共2 h，使细胞均匀附着于内壁。以后剪开封闭口，放入MCDB131培养液中孵育1 d。
人工血管植入及体内实验：将18只成年新西兰大白兔随机数字表法分成3组，每组6只。其中正常细胞组移植未种植细胞的人工血管，lacZ转染组移植种植了转染lacZ的平滑肌细胞的人工血管，内皮型一氧化氮合酶转染组移植种植了转染内皮型一氧化氮合酶的平滑肌细胞的人工血管。将大白兔麻醉后，用动脉夹夹住腹主动脉，纵向切开腹主动脉，切口长约4 mm。用6-0滑线将长5 cm、直径4 mm，种植细胞的聚四氟乙烯人工血管端侧吻合腹主动脉上。用同样的方法吻合远端。术中避免损害血管上的细胞，防止细胞脱水，手术前后给予100 U/kg 肝素及抗生素防治感染。在术后30，100 d 后收集人工血管用于观察每组内膜形成的变化及增生情况。
移植血管内膜的分析：收集的血管用磷酸盐缓冲液冲洗后，切2/3长的血管段做血管内膜分析。将血管切成3部分，分别为近吻合端、近端1/3、血管中段，在适宜的温度包埋后做冰冻切片(4 μm)。用X-gal染色及苏木精-伊红染色观察人工血管上的平滑肌细胞（种植的平滑肌细胞为蓝色，而内源性细胞为红色）。每段血管内膜增生的程度在显微镜下用标尺测量。内膜的厚度为吻合端、近端1/3、血管中段厚度的平均值。
主要观察指标：①培养的血管平滑肌细胞免疫组织化学染色。②转染内皮型一氧化氮合酶基因细胞培养上清中一氧化氮含量。③转染lacZ基因后β-gal的活性。④移植后的人工血管内膜厚度。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0软件完成统计处理，实验数据以_x±s表示，组间数据分析用t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析纳入成年新西兰大白兔18只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 原代培养的血管平滑肌细胞免疫组织化学染色鉴定原代培养的细胞98%用α－平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色呈阳性，倒置显微镜下可见胞核外周呈棕黄色，胞质中有较多的条丝状物，即为肌动蛋白，见图１。
2.3 平滑肌细胞转染内皮型一氧化氮合酶及LacZ基因的测定采用瓜氨酸测定法检测细胞培养基上清中一氧化氮的含量，结果显示内皮型一氧化氮合酶转染组一氧化氮含量为（87.3±15.0）μmol/L，明显高于未转染的正常细胞组(52.4±13.6)μmol/L（P < 0.05）。平滑肌细胞转染lacZ基因后经X-gal染色，倒置显微镜下可见转染了基因的细胞被染成蓝色，见图2。

2.4 不同时间点观察种植转染血管平滑肌细胞后人工血管内膜的厚度见表1。

表1显示，植入血管平滑肌细胞100 d 后每组内膜厚度均大于植入30 d。血管平滑肌细胞植入30 d，正常细胞组与lacZ转染组内膜厚度差异无显著性（P > 0.05）；植入100 d 两组差异显著（P < 0.05），提示单纯种植血管平滑肌细胞长期可以引起明显的血管内膜增生。植入100 d 后，内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度和正常细胞组相近，但内皮型一氧化氮合酶转染组的数值最小，提示，内皮型一氧化氮合酶种植到血管平滑肌细胞的表达可以抑制内膜增生。
种植的平滑肌细胞被转入LacZ基因以区别于内源性平滑肌细胞。植入期间观察细胞增殖状态及向内膜移行的情况，植入血管的吻合口处和中段无明显差别。内皮型一氧化氮合酶转染组内膜最薄，提示内皮型一氧化氮合酶的表达可以抑制血管内膜的增生，见图3。

目前很多实验都认为无论是自体血管还是人工血管，血管增生是移植管再狭窄的主要原因。广泛的平滑肌细胞增生和移行是血管纤维肌性内膜增生的主要原因[9]。
增生内膜由20%血管平滑肌细胞和60%~80%胞外基质构成。血管平滑肌细胞由中膜迁移至内膜并大量增殖、分泌胞外基质是血管内膜增生中的主要病理变化，因此血管平滑肌细胞是重要的靶细胞。
抑制平滑肌细胞增生的方法有在平滑肌细胞上种植内皮细胞。内皮细胞内含有的内皮型一氧化氮合酶催化L-精氨酸生成一氧化氮。一氧化氮弥散至周围的血管平滑肌细胞中，激活可溶性鸟苷酸环化酶，使GTP转化为cGMP，从而介导了血管的松弛效应及抑制血小板粘附和平滑肌细胞的增殖与迁移[10]。已有报道认为平滑肌细胞和内皮细胞共同种植可以抑制平滑肌细胞增生[11-12]。有体内实验认为再内皮化可以抑制损伤血管壁的广泛内膜增生[13]。
抑制平滑肌细胞增生的方法还有利用一氧化氮供体释放一氧化氮[4，14-15]，或是用基因转染方法调控平滑肌细胞的增生，例如转染一氧化氮合酶基因[16-18]。高一氧化氮合酶的表达可以促进一氧化氮的生成。一氧化氮是内皮细胞产生的重要血管活性物质，可以促进血管舒张，抑制血管平滑肌细胞增殖，增加内皮细胞表达内皮细胞生长因子，从而促进损伤血管内膜内皮化，减轻新内膜形成。血管移植破坏了血管内皮，一氧化氮合成相应减少。内源性一氧化氮是在一氧化氮合酶催化下，由L-精氨酸和氧分子共同作用生成的。一氧化氮合酶是受一氧化氮合酶基因调控的，所以有研究通过一氧化氮合酶基因转染的方式来恢复一氧化氮的生成，在体内和体外重组一氧化氮合酶基因异构体的表达可以改变各种血管床的功能[19]。国内外均有报道认为转染内皮型一氧化氮基因可以抑制内膜增生[18,20-22]。内皮型一氧化氮合酶转染血管平滑肌细胞通过上调P21、P27、P53水平延长细胞增殖周期来抑制平滑肌细胞的增殖[23-24]。
在本实验中，用兔血管平滑肌细胞作为中介细胞，在体外培养后转入目的基因内皮型一氧化氮合酶。将转染了内皮型一氧化氮合酶基因的平滑肌细胞种植到人工血管上，用旁路移植的方法植入兔体内。通过观察血管植入后人工血管内膜的厚度，可以看到植入30 d 时，3组内膜的厚度差异无显著性（P > 0.05)；植入100 d 时，内皮型一氧化氮合酶转染组的内膜厚度与lacZ转染组相比较，差异显著（P < 0.05），和正常细胞组无明显差异（P > 0.05)，说明内皮型一氧化氮合酶可以抑制血管平滑肌细胞的生长。
在基因转染方面，目前用于体内内皮型一氧化氮合酶基因转染的载体有假型反转录病毒载体[25]、腺病毒载体[26]和脂质体[27]等。腺病毒的病毒滴度较高，而且可转染分化细胞，然而其缺陷是具有较大的毒性，易引起机体的免疫反应，从而影响转染效果。小鼠白血病病毒作为常用的反转录病毒载体，因为转导效率较低而限制了它的广泛应用。应用疱疹性口炎病毒G糖蛋白修饰的鼠白血病病毒（MuLV/VSV-G）载体，明显提高了基因转导入人的平滑肌细胞的效率[7]。反转录病毒载体用于基因转染理论上具有选择定位作用[7]，使基因转移和发挥作用只发生在血管病变部位，达到治疗目的。而且反转录病毒载体只能转染正处于有丝分裂状态的细胞[28]，对正常细胞无影响。
本实验通过转染一氧化氮合酶基因抑制内膜的增殖，提高了人工血管植入后的通畅率，但是同时也观察到在植入血管中有血栓的形成，今后笔者将进一步进行相关的实验。

1 Nylaende M，Kroese A，Stranden E，et al. Markers of vascular inflammation are associated with the extent of atherosclerosis assessed as angiographic score and treadmill walking distances in patients with peripheral arterial occlusive disease. Vasc Med 2006；11(1):21-28
2 Hansson GK，Libby P. The immune response in atherosclerosis：a double-edged sword. Nat Rev Immunol 2006;6(7):508-519
3 Luscher TF，Tanner FC. Endothelial regulation of vascular tone and growth. Am J Hypertens 1993;6 (7 Pt 2):283S-293S
4 Hou D，Narciso H,Kamdar K,et al. Stent-based nitric oxide delivery reducing neointimal proliferation in a porcine carotid overstretch injury model. Cardiovasc Intervent Radiol 2005;28 (1):60-65
5 Soneoka Y,Cannon PM, Ramsdale EE,et al. A transient three-plasmid expression system for the production of high titer retroviral vectors. Nucleic Acids Res 1995;23(4):628-633
6 Han JY,Cannon PM,Lai KM,et al. Identification of envelope protein residues required for the expanded host range of 10A1 murine leukemia virus. J Virol 1997;71(11):8103-8108
7 Yu H,Eton D,Wang Y,et al. High efficiency in vitro gene transfer into vascular tissues using a pseudotyped retroviral vector without pseudotransduction. Gene Ther 1999;6(11):1876-1883
8 Eton D,Terramani TT,Wang Y,et al. Genetic engineering of stent grafts with a highly efficient pseudotyped retroviral vector. J Vasc Surg 1999;29(5):863-873
9 Fischer JW,Hawkins S,Clowes AW,et al. Pharmacologic inhibition of nitric oxide synthases and cyclooxygenases enhances intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid arteries. J Vasc Surg 2004；40 (1)：115-122
10 Gattullo D,Pagliaro P,Marsh NA,et al. New insights into nitric oxide and coronary circulation. Life Sci 1999；65 (21)：2167-2174
11 Vouyouka AG,Jiang Y,Basson MD. Pressure alters endothelial effects upon vascular smooth muscle cells by decreasing smooth muscle cell proliferation and increasing smooth muscle cell apoptosis. Surgery 2004；136(2)：282-290
12 Sakamoto N,Ohashi T,Sato M. Effect of fluid shear stress on migration of vascular smooth muscle cells in cocultured model. Ann Biomed Eng 2006;34(3):408-415
13 Schwartz SM,O'Brien ER,Deblois D,et al. Relevance of smooth muscle replication and development to vascular disease. In:Schwartz SM,Mecham RP,editors. The vascular smooth muscle cell. 1st ed. San Diego:Academic Press Inc 1995：81-121
14 Tanner FC,Largiadèr T,Greutert H,et al. Nitric oxide synthase gene transfer inhibits biological features of bypass graft disease in the human saphenous vein. J Thorac Cardiovasc Surg 2004;127(1):20-26
15 Ahanchi SS，Tsihlis ND，Kibbe MR. The role of nitric oxide in the pathophysiology of intimal hyperplasia. J Vasc Surg 2007;45 Suppl A:A64-A73
16 Pfeiffer T，Wallich M，Sandmann W，et al. Lipoplex gene transfer of inducible nitric oxide synthase inhibits the reactive intimal hyperplasia after expanded polytetrafluoroethylene bypass grafting. J Vasc Surg 2006;43(5):1021-1027
17 Wu S，Wang X，Guo L，et al. Adenovirus mediated endothelial nitric oxide synthase gene transfer prevents restenosis of vein grafts. ASAIO J 2004;50(3):272-277
18 Cooney R，Hynes SO，Duffy AM，et al. Adenoviral-mediated gene transfer of nitric oxide synthase isoforms and vascular cell proliferation. J Vasc Res 2006;43(5):462-472
19 Gao PJ，Zhu DL，Chen YY. Zhonghua Xinxueguanbing Zazhi 1999;27（6）：52-54
高平进，朱鼎良，陈玉英.蛋白激酶Ca与血管平滑肌细胞表型转化[J].中华心血管病杂志,1999,27(6):52-54
20 Chen L,Daum G,Forough R,et al. Overexpression of human endothelial nitric oxide synthase in rat vascular smooth muscle cells and in balloon-injured carotid artery. Circ Res 1998;82(8):862-870
21 Xue GH,Zhang JW,Zhang L,et al. Endothelial nitric oxide synthase gene transfected endothelial cells inhibit smooth muscle cell proliferation and platelet aggregation early in vitro. Zhonghua Wai Ke Za Zhi 2004；42 (22)：1349-1352
22 Tao DS,Zhang RF,Wang HS,et al. Disi Junyi Daxue Xuebao 2005;26 (7):591-593
陶登顺，张仁福，王辉山，等.内皮型一氧化氮合酶基因转染在兔颈静脉移植血管桥中的表达[J].第四军医大学学报,2005,26 (7):591-593
23 Sato J,Nair K,Hiddinga J,et al. eNOS gene transfer to vascular smooth muscle cells inhibits cell proliferation via upregulation of p27 and p21 and not apoptosis. Cardiovasc Res 2000;47(4):697-706
24 D'Souza FM,Sparks RL,Chen H,et al. Mechanism of eNOS gene transfer inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation. Am J Physiol Cell Physiol 2003;284(1):C191-C199
25 Kong D,Melo LG,Mangi AA,et al. Enhanced inhibition of neointimal hyperplasia by genetically engineered endothelial progenitor cells. Circulation 2004；109(14)：1769-1775
26 Ning SB,Zhang ZB,Xie WF,et al. Construction of a recombinant adenovirus carrying endothelial nitric oxide synthase gene and its expression and control in esophageal smooth muscle cells. Chin J Dig Dis 2004；5(1)：17-21
27 Zhang ZQ,Qiu JF,Luo M,et al. Liposome-mediated gene transfer of endothelial nitric oxide synthase to cirrhotic rat liver decreases intrahepatic vascular resistance. J Gastroenterol Hepatol 2007；5 [Epub ahead of print]
28 Miller DG,Adam MA,Miller AD. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection. Mol cell Biol 1990;10(8):4239-4242