颈动脉球囊损伤模型大鼠核转录因子κB变化与颈动脉血管内膜增生的关系☆

姜昕1，2，董少红2，廖玉华1，刘华东1，2

课题背景：目前已知平滑肌细胞过度增殖是血管支架置入或血管成形后发生再狭窄的重要病因，但平滑肌细胞增殖的信号转导途径尚不完全清楚。认识平滑肌细胞增殖的信号转导途径对于阐明其发病机制具有重要意义。

应用要点：①本课题通过建立大鼠颈动脉内膜损伤模型，在以往实验的基础上进一步观察了大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增殖发生再狭窄及局部核因子κB的表达变化。②结果提示损伤血管弹性回缩、新生内膜形成及负性重塑（慢性缩窄）是再狭窄发生的主要机制，核因子κB在球囊损伤后对血管平滑肌的增殖和迁移及再狭窄起着推动作用。

相关链接：平滑肌细胞迁移、增殖是新生内膜形成及再狭窄的关键因素，多种刺激因素均能诱导平滑肌细胞增殖，近年研究表明核转录因子κB的激活在平滑肌细胞增殖中起着至关重要的作用。��

1华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科，湖北省武汉市 430022；2暨南大学第二临床医学院（深圳市人民医院）心内科，广东省深圳市
518020

姜昕☆，女，1974年生，广东省深圳市人，汉族，华中科技大学同济医学院在读博士，主治医师，主要从事介入心脏病学的研究。
Jiangxin99@tom.
com

通讯作者：董少红，主任医师，暨南大学第二临床医学院（深圳市人民医院）心内科，广东省深圳市 518020
dsh266@medmail.
com.cn

廖玉华，主任医师，华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科，湖北省武汉市 430022
liaoyh27@163.com

摘要
目的:新生内膜异常增殖是血管成形术后再狭窄的主要原因，但其机制目前还不清楚。观察大鼠颈动脉球囊损伤术后核因子κB表达的变化及其与动脉内膜增生和血管重塑的关系。
方法：实验于2007-01/05在深圳市人民医院动物实验中心完成。①实验材料：SPF级雄性SD大鼠36只，体质量350 g 左右。②实验方法：将大鼠一侧颈动脉行球囊损伤术作为实验组，另一侧颈动脉作为对照组，分别在颈总动脉球囊损伤后6 h，3，7，14，28 d 后麻醉并处死大鼠，留取两侧颈总动脉标本。③实验评估：应用组织形态学方法检测内膜增生并进行计算机图像分析；同时通过凝胶电泳迁移率实验测定核因子κB的活性。
结果：纳入大鼠36只，因造模失败和死亡排除6只，进入结果分析30只。①球囊损伤后，内膜面积在7，14，28 d 逐渐增厚，内膜/中层比率增长，与对照组比较，差异显著（P < 0.05）。两组的中膜面积无明显变化。血管重塑指数在损伤后6 h 最大，之后不断减小。②核因子κB在对照组几乎不表达。而球囊损伤后6 h 即可见核因子κB表达，并于14 d 达高峰，28 d 仍有较强表达。实验组核因子κB各时间点与对照组比较差异均有显著性(P < 0.05)。
结论：大鼠颈动脉球囊损伤术后，核因子κB被迅速激活并持续增加，可能是内膜增生、血管重塑的重要机制之一。
关键词：颈动脉球囊；核转录因子；血管内膜；增生；组织构建

姜昕，董少红，廖玉华，刘华东. 颈动脉球囊损伤模型大鼠核转录因子κB变化与颈动脉血管内膜增生的关系[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(7):1230-1234 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1230(ps).pdf]

Correlation between nuclear factor-kappa B and vascular intimal hyperplasia in rat carotid artery after balloon catheter injury

AIM:Neointimal hyperplasia is the main reason for vascular restenosis after angioplasty. The mechanism is uncertain. This study explored nuclear factor-κB (NF-κB) expression changes after balloon catheter injury and its correlation with intimal hyperplasia of carotid artery and vascular remodeling.
METHODS: The experiment was performed at Animal Experimental Center of Shenzhen People's Hospital from January to May 2007. ①Thirty-six male SPF SD rats weighing about 350 g were selected, and subjected to balloon catheter injury at one side carotid artery as experimental group and the other side as control group. All rats were executed under anesthesia on the 6th hour, and 3rd, 7th, 14th, and 28th days after balloon injury, respectively to harvest common carotid artery samples. ②The intimal thickness and the expression of NF-κB were detected by HE-staining and gel electrophoretic mobility shift assay (EMSA) methods.
RESULTS: Of the 36 rats, 6 were excluded due to failed modeling and death, and 30 rats were included in final analysis. ①The thickening of intima was observed on the 3rd day after balloon injury, and became more significant on the 7th, 14th, and 28th days. The area ratio of intima/media was increased significantly compared with control group (P < 0.05). Vascular remodeling index reached the peak 6 hours after injury, and decreased thereafter. ②The expression of NF-κB was hardly observed in the control group. In injured rat carotid artery, NF-κB expression was firstly found 6 hours after injury, peaked on the 14th day, and remained high expression to the 28th day. There were significant differences at each point between experiment and control groups (P < 0.05).
CONCLUSION: After balloon catheter injury in rats, NF-κB is rapidly activated and enhanced gradually, which may be one of the important mechanisms for intimal hyperplasia and vascular remodeling.

Jiang X, Dong SH, Liao YH, Liu HD. Correlation between nuclear factor-kappa B and vascular intimal hyperplasia in rat carotid artery after balloon catheter injury.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(7):1230-1234(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1230(ps).pdf]

经导管介入治疗是目前治疗冠心病的重要方法，尤其在急性冠脉综合征患者中的应用得到肯定。但血管成形术后再狭窄却严重限制了其远期疗效，这就使得再狭窄的防治成为当今心血管病研究的重要课题之一。而目前已知再狭窄的发病机制主要是新生内膜形成和血管重塑。核因子κB (Nuclear factor-kappa，NF-κB)作为一种能调控多种基因的具有多种效应的转录因子[1]，已被证实参与动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄和其他血管增殖性病变等病理生理过程。故此，本实验应用大鼠颈动脉球囊损伤模型进一步观察血管内皮损伤后NF-κB活性变化及其与内膜增生和血管重塑的关系。

设计：重复测量，对比观察。
单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院，深圳市人民医院。
材料：实验于2007-01/05在深圳市人民医院动物实验中心完成。SPF级雄性SD大鼠36只，体质量350 g 左右，购自广东省实验动物中心（动物合格证号：0022488）。
主要试剂及仪器：100 g/L 水合氯醛、普通肝素钠（北京鼎国）；NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（PIERCE）；LIGHTSHIFT EMSA KIT（PIERCE）；PMSF（PIERCE）；丽春红、二巯基乙醇（Sigma）。NF-κB的探针序列（生物素化标记）：5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C -3’；3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G -5’。显微手术器械（上海手术器械二厂）；手术显微镜、普通光学显微镜（Olympus公司，日本）；经皮冠状动脉球囊导管(2.0 mm×10.0 mm，Medtronic公司)；酶标仪、电泳槽、转膜仪、电泳仪、转膜槽（Bio-RAD，美国）；磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）；脱色摇床（上海琪特分析仪有限公司）；WS-Ⅲ型卡片式暗盒（Alphaimager公司，美国）；凝胶图像分析系统BioSenSC300（上海山富科学仪器有限公司）。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者，干预实施为第一、四作者，评估为第一、二、三作者。第一作者为心内科博士生，第二、三作者为心内科博士生导师，均长期从事心血管病的研究，采用盲法评估。
方法：
大鼠颈动脉球囊导管损伤模型的建立：将SD大鼠腹腔注射100 g/L 水合氯醛(0.3 mg/kg)麻醉，从尾静脉注射肝素钠100 U/kg，取颈部正中切口，寻找到左颈总动脉和颈外、颈内动脉分叉处，在左颈总动脉近心端暂时阻断血流，从颈外动脉处行动脉切开术，将Medtronic囊导管(2.0 mm×10.0 mm)从切口插入至颈总动脉约1.5 cm，以2 atm 充盈球囊，向远心端牵拉导管剥脱内膜，抽去生理盐水，再送向近心端，重复上述操作3次，然后撤出导管，结扎颈外动脉，去除血管夹，恢复血流，缝合伤口，送回动物观察室。术后肌注青霉素20万单位/d，共3 d，预防感染。另取对侧颈总动脉作为对照，仅分离右侧颈总动脉和颈内、外动脉，不予切开。
指标检测：分别取两侧颈总动脉检验。动物麻醉后行颈部皮肤切开，分离颈总动脉，从颈总动脉分叉处开始向近心端取出损伤部位的左颈总动脉约1.0 cm 左右，其中0.5 cm 颈动脉浸泡于体积分数为0.1的甲醛中固定3~6 h（其余部分迅速放入液氮内保存，准备行NF-κB检
测），常规石蜡包埋后行病理切片，每份标本非连续取4处切片，切片厚度4 μm，选取球囊损伤后血管结构保留完整、血管形态接近在体生理状态的动物标本，分别于术后 6 h，3，7，14，28 d 分批麻醉后处死，保证每个时间点6只大鼠，常规苏木精-伊红染色，光镜下观察血管内膜增生情况。利用Quantiment 520型计算机图像分析仪分别测量动脉管腔面积(Lumen)、内膜面积(Intia)、外膜面积(EEL)和中膜横断面的面积(Media)，并计算内膜/中层面积比。以内弹力膜区别内膜和中膜，测量管腔面积以及内、外弹力板包绕面积(面积单位均以mm2表示)；内膜面积=内弹力板包绕面积－管腔面积；中膜面积=外弹力板包绕面积－内弹力板包绕面积；血管重塑指数(VRI)=损伤侧外弹力板围绕面积 (EELA)/对照侧外弹力板围绕面积(IELA)。
增生程度=内膜面积(I)/ 中膜面积(M)。测量采用单盲法，测量者为与本实验无关者。
凝胶电泳迁移率实验检测NF-κB活性：核蛋白提取，取液氮冻存大鼠颈动脉组织，剪碎，液氮中研成粉末，400 μL A液重悬，冰上膨胀15 min，振荡10 s。20 000 g 离心10 s，弃上清，25~40 μL B液重悬细胞核。冰上放置20 min，不时搅动，20 000 g 离心5 min，取上清，测定蛋白浓度，分装保存-80 ℃。NF-κB的探针序列用生物素化标记，取5 μL 核蛋白提取物与配制好的缓冲液配成总体积20 μL，结合反应液在室温20 min 进行结合反应，然后行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，100 V 电泳80 min，100 V 转膜60 min，70 ℃ 固定1 h。化学发光检测生物素标记DNA，最后将膜放于胶卷盒中，在X射线下显影。并同时设空白对照、竞争性对照及非竞争性对照。应用50倍浓度未标记的NF-κB寡核苷酸作竞争对照来证实其特异性。非竞争性对照选用50倍浓度未标记的AP-1寡核苷酸序列。
主要观察指标：大鼠颈动脉球囊损伤后不同时间点组织病理变化和各指标比较及血管内NF-κB活性变化。
统计学方法：NF-κB活性检测结果用凝胶成像与分析系统进行积分吸光度分析。由第一作者采用SPSS 12.0软件完成统计处理。实验数据以_x±s表示，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析纳入大鼠36只，因造模失败和死亡排除6只，进入结果分析30只。
2.2 大鼠颈动脉球囊损伤后不同时间点各指标比较见表1。

光镜下观察对照组管腔面内膜无明显变化，内皮细胞、内弹力板完整，仅见单层血管内皮细胞，中膜由3~ 5层环形排列的弹性膜和平滑肌细胞组成，排列整齐。内弹力板呈波浪形，有弹性，见图1a。
实验组损伤后6 h 可见血管内膜剥脱，局部偶有内弹力板断裂，无明显中膜变化，外膜轻度扩张，见图1b。
损伤后3 d，内膜开始增生，可见中层弹力板僵直，中膜轻度增厚，外膜继续扩张，见图1c。
损伤后7 d 新生内膜形成，显著增厚，增生细胞排列紊乱，内膜面积、外膜面积与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，但内膜面积扩张更明显，I/M面积比与对照组相比差异也有显著性(P < 0.05)，见图1d。
损伤后14 d，细胞外基质增加，平滑肌细胞增生，内膜继续增厚，外膜面积达到最大，I/M面积比继续增大，见图1e。
球囊损伤后28 d，动脉壁明显增厚，以内膜增厚为主，管腔极度狭窄，内膜中有大量细胞外基质与平滑肌细胞，见图1f。
I/M面积比此时最大，与7，14 d 时比较差异有显著性意义（P < 0.05）；7，14，28 d 各组间比较差异显著（P < 0.05）。血管重塑指数在球囊损伤后6 h 达到最大，其后为不断减小的过程。
2.3 大鼠颈动脉球囊损伤后血管内NF-κB活性的变化
2.3.1 EMSA特异性鉴定阴性对照(见图2，泳道1)：是在反应物中加生物素标记NF-κB探针，而未加核蛋白提取物，故未见到有NF-κB 结合探针的滞后条带；阳性对照(见图2，泳道2)：是在反应物中加生物素标记NF-κB 探针和颈动脉损伤后3 d 核蛋白提取物，出现非常强的NF-κB 滞后条带。特异性竞争性抑制(见图2，泳道3)：是在反应物中加入50倍过量的未标记NF-κB 探针，可显著地阻断生物素标记的NF-κB探针与核蛋白提取物中NF-κB的结合，没有见到NF-κB滞后条带的出现。非特异性竞争性抑制(见图2，泳道4)：加入50倍过量的未标记AP-1探针，对生物素标记NF-κB探针与核蛋白提取物中NF-κB 的结合无明显影响。对照质控实验的结果表明，该方法有很高的特异性。

2.3.2 不同组间NF-κB活性比较对照组大鼠NF-κB的DNA结合活性很低，与对照组比较，实验组NF-κB活性明显增高(P < 0.05)。在球囊损伤后6 h NF-κB表达即明显增加，损伤后14 d NF-κB表达达高峰，实验组各个时间点均较前一时间段NF-κB表达增强(P < 0.05)；28 d 时仍有较高表达，但较14 d 时下降。凝胶电泳结果见图3，图4。

近年来研究结果表明，新生内膜形成及血管重塑是血管成形术后再狭窄的主要原因[2-4]。而这一过程是由多种细胞因子和生长因子介导的[5]，包括复杂的炎症反应[6]、血管平滑肌细胞增殖、迁移、凋亡及细胞基质大量分泌和堆积[7]。
目前已知NF-κB是调控多种细胞基因转录的关键因子之一[8]，与一系列细胞因子、炎症介质及蛋白酶类的产生、细胞增殖、细胞外基质堆积和细胞凋亡有关[9-11]。在静息细胞中NF-κB以非活性形式存在于细胞浆，当外界因素作用于细胞后，NF-κB得以激活，进入细胞核[12]，与靶基因的启动子和增强子中的κB序列特异结合，参与炎症反应、内皮细胞活化及平滑肌细胞增殖等有关基因的转录和调控。近年研究表明，NF-κB的激活是血管平滑肌细胞增殖的必经和始动环节[10]。Carter等[13]报道NF-κB可以参与凝血酶受体激活剂、碱性成纤维细胞生长因子等多种刺激因素诱导的血管平滑肌细胞增殖，并且在其增殖过程中NF-κB激活及DNA结合活性增加。
由于NF-κB激活后和相应基因调控区域位点结合才能发挥转录调控的作用。故本实验通过凝胶电泳迁移率实验方法检测NF-κB与DNA上特异性位点结合的量，从而比较并评价在血管球囊损伤术后NF-κB的活性变化及其功能状态。实验发现NF-κB在对照组几乎没有表达，而实验组在损伤后即刻就明显表达，并呈持续增加，14 d 达高峰，28 d 时仍有较高表达，这与文献报道相似[14]。本实验组织形态学检查结果显示球囊损伤可导致动脉内皮剥脱，内膜弹力板断裂，损伤后增生的内膜主要是由平滑肌细胞、大量泡沫细胞、细胞外基质及少量的纤维结缔组织构成，平滑肌细胞大量增生与细胞基质一起造成了管腔的狭窄。
众所周知，炎症反应在血管损伤后再狭窄过程中起到非常重要的作用[15-16]，而损伤因素通过激活NF-κB而促使各种细胞因子产生，从而参与并扩大炎症反应，引起平滑肌细胞增殖迁移，血管重塑等，加速再狭窄的进程。本实验结果显示，球囊损伤后NF-κB的动态变化与内膜增生、血管重塑的动态变化趋势一致并稍提前，提示在大鼠颈总动脉球囊损伤后，NF-κB被激活，从而成为引起内膜增生和再狭窄的始动环节之一。综上所述，将NF-κB作为防治再狭窄的一个分子靶向研究切入点[17]，从不同环节抑制NF-κB的活性[18-20]，将为再狭窄的防治提供新的手段。

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