5-氟尿嘧啶对体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制及半数抑制浓度*★

左宗宝，李小静，宁金龙，龚轶一，潘祝斌，周瑜

课题背景：课题为安徽省教育厅自然科学基金资助项目(070413102)。5-氟尿嘧啶是传统抗代谢药物，其诱导多种肿瘤细胞的凋亡已得到充分论证，近来国内外均有5-氟尿嘧啶应用于病理性瘢痕治疗的临床报道，但其药物作用机制尚无确切认定。本实验利用体外细胞培养技术，探索5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的生物学影响。

应用要点：实验证实低浓度5-氟尿嘧啶对体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞有抑制增殖和诱导凋亡作用。在药物细胞毒性较弱的浓度范围下，随药物浓度的增加，细胞凋亡率随之升高。采用低浓度、短周期注射5-氟尿嘧啶可能是治疗瘢痕疙瘩较为安全、有效的方法。

同行评价：文章观察5-氟尿嘧啶对体外瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学影响是对5-氟尿嘧啶治疗瘢痕疙瘩机制的有益探讨，特别是探讨了5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞的半数抑制浓度，对于指导临床应用具有重要价值。��

1华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科，湖北省武汉市 430022；2暨南大学第二临床医学院（深圳市人民医院）心内科，广东省深圳市
518020

左宗宝★，男，1981年生，安徽省安庆市人，汉族，安徽医科大学在读硕士，住院医师，主要从事瘢痕基础方面的研究。
ayzuozongbao@
yahoo.com.cn

通讯作者：李小静，教授，硕士生导师，安徽医科大学第一附属医院整形外科，安徽省合肥市 230032
lixiaojing5@163.com

摘要
目的:国内外一些学者使用传统抗代谢药物5-氟尿嘧啶防止纤维化，在治疗瘢痕疙瘩方面取得了一定的临床疗效，但对其药物作用机制以及临床药物应用的浓度尚无确切认定。实验拟进一步验证5-氟尿嘧啶对体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的抑制以及半数抑制浓度。
方法：实验于2006-09/2007-07在安徽医科大学微生物教研室及安徽医科大学附属医院中心实验室完成。①实验材料：6例瘢痕疙瘩（耳垂、大腿各1例、胸前、上臂各2例）均为安徽医科大学附属医院整形外科手术病例，均无系统性疾病和激素、其他药物注射史，对用于实验的所取组织患者均知情同意。治疗方案经医院医学伦理委员会批准。②实验方法：成纤维细胞体外原代培养，待细胞融合后传代，实验所用细胞均为处于4~8代对数生长期的成纤维细胞。将不同浓度5-氟尿嘧啶(0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 g/L)分别对4~8代瘢痕疙瘩成纤维细胞进行干预72 h。再选用接近IC50的5个浓度：0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 g/L，作为余下实验浓度。③实验评估：采用四甲基偶氮唑盐比色法检测各浓度药物对成纤维细胞的抑制率，计算5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞的半数抑制浓度（IC50）值。应用流式细胞术分析法观察5-氟尿嘧啶干预后瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞周期变化及细胞凋亡百分率；应用Hoechst 33258荧光染色法观察凋亡成纤维细胞的形态学特征。
结果：6例瘢痕疙瘩标本原代培养成纤维细胞成活良好，均用于实验，进入结果分析。①0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 g/L 5-氟尿嘧啶干预72 h 后，细胞抑制率组间两两比较差异均有显著性（P < 0.01）。作图得半数抑制浓度IC50为（0.400±0.032）g/L。②0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 g/L 5-氟尿嘧啶干预48 h 后，细胞凋亡率组间两两比较差异显著（P < 0.05），与对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.01)；实验组与对照组细胞周期百分数比较，表现为G0/G1期停滞，S期减少，各组间两两比较差异有显著性意义（P < 0.05）。③各浓度5-氟尿嘧啶干预48 h 后，Hoechst 33258荧光染色观察成纤维细胞均发生不同程度凋亡。
结论：5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。低浓度、短周期注射5-氟尿嘧啶可能是治疗瘢痕疙瘩的一种新思路。
关键词：瘢痕疙瘩；氟尿嘧啶；成纤维细胞；细胞增殖；细胞凋亡；组织构建

左宗宝，李小静，宁金龙，龚轶一，潘祝斌，周瑜．5-氟尿嘧啶对体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制及半数抑制浓度[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(7):1235-1238 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1235(ps).pdf]

Inhibitory effect of 5-fluorouracil on in vitro cultured human keloid fibroblasts and determination of 50% inhibitory concentration of 5-fluorouracil

AIM:5- fluorouracil is always used to prevent fibrosis, which has achieved certain curative effect on keloid in clinic. However, its mechanism and application dosage in clinic are still uncertain. This study explored the inhibitory effects and concentration of 5-fluorouracil on the proliferation of human keloid fibroblasts in vitro.
METHODS: The experiment was performed at Microbes Department of Anhui Medical University and the center laboratory of Affiliated Hospital of Anhui Medical University from September 2006 to July 2007. ①Keloids of ear lobe, thigh, chest and upper arm were derived from 6 cases of Department of Plastic Surgery, First Affiliated Hospital of Anhui Medical University. All the patients did not have any systemic disease or drug injection like hormone. The informed consent was obtained from the patients, and the experiment was admitted by the Hospital Ethics Committee. ②Fibroblasts were cultured in vitro, and the Ⅳ-Ⅷ generation cells at exponential phase of growth were used for experiment. Keloid fibroblasts were stimulated with 5-fluorouracil (0.1, 0.2, 0.4, 0.8, and 1.6 g/L) for 72 hours. In addition, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 and 0.6 g/L 5-fluorouracil were prepared for the following experiment. ③The inhibition ratio and 50% inhibitory concentration (IC50) were calculated by MTT. The cell apoptosis and cell cycle were measured by flow cytometry. The cell morphological character was observed by Hoechst 33258 fluorescent staining.
RESULTS: Six keloid specimens were primarily cultured well, and all were included in the final analysis. ①After 5-fluorouracil (0.1, 0.2, 0.4, 0.8, and 1.6 g/L) intervention for 72 hours, the inhibition ratio were significantly different between every two groups (P < 0.01). The IC50 was (0.400±0.032) g/L by mapping. ②After 5-fluorouracil (0.2, 0.3, 0.4, 0.5, and 0.6 g/L) intervention for 48 hours, the apoptosis rate had significant differences between every two groups (P < 0.05). Compared with the control group cells, the differences were statistically significant (P < 0.01). Compared with the control group cells, the number of experiment cells at phase G0/G1 significantly increased and S decreased (P < 0.05). ③By Hoechst 33258 fluorescent staining, the keloid fibroblasts interfered with 5-fluorouracil showed apoptosis at different extents.
CONCLUSION: 5-fluorouracil can inhibit proliferation and induce apoptosis of human keloid fibroblasts in vitro. Low concentration and short-period injection with 5-fluorouracil would be a new ideal for keloid treatment.

Zuo ZB, Li XJ, Ning JL, Gong YY, Pan ZB, Zhou Y. Inhibitory effect of 5-fluorouracil on in vitro cultured human keloid fibroblasts and determination of 50% inhibitory concentration of 5-fluorouracil .Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(7):1235-1238(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1235(ps).pdf]

瘢痕疙瘩切除后易复发，治疗较为棘手，是目前整形外科的难题之一[1-2]。手术切除和药物注射治疗仍是常用的主要治疗方法。用于防治瘢痕疙瘩的药物种类较多，近年来，国内外报道应用传统抗代谢药物5-氟尿嘧啶防止纤维化，在治疗瘢痕疙瘩方面取得了一定的临床疗效[3-7]，但对其作用机制以及临床药物应用的浓度尚无确切认定。本实验采用四甲基偶氮唑盐法、流式细胞术分析法、Hoechst 33258荧光染色法，观察了5-氟尿嘧啶对体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的生物学影响，旨在为药物临床应用提供实验依据。

设计：重复测量观察。
单位：安徽医科大学第一附属医院整形外科。
对象：实验于2006-08/2007-07在安徽医科大学微生物教研室及安徽医科大学附属医院中心实验室完成。6例瘢痕疙瘩（耳垂、大腿各1例、胸前、上臂各2例）均为安徽医科大学附属医院整形外科手术病例，年龄19~28岁，男2例，女4例，病程1~3年，均无系统性疾病和激素、其他药物注射史，对用于实验的所取组织患者均知情同意。治疗方案经医院医学伦理委员会批准。
主要试剂及仪器：DMEM、Hoechst 33258荧光染色剂(Gibco公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；5-氟尿嘧啶(天津光耀氨基酸有限公司，规格：每支250 mg/10 mL)；四甲基偶氮唑盐、PI(Sigma公司)。流式细胞仪（FACScan型，美国BD公司）。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者，干预实施为第一、四作者，评估为第二、三作者，均受过相关实验的正规培训。
方法：
瘢痕疙瘩成纤维细胞培养：将组织标本用含100 U/L 青霉素和100 U /L 链霉素的磷酸盐缓冲液反复冲洗3次，去皮下组织和表皮，剪成1 mm×1 mm×1 mm 左右的小块，均匀分布于培养瓶底，加入少量含体积分数为0.15小牛血清的DMEM液，置入温箱原代培养。待细胞融合后传代，实验所用细胞均为第4~8代处于对数生长期的成纤维细胞。
四甲基偶氮唑盐法：将对数生长期的成纤维细胞密度设定为2.5×105/孔，接种于96孔板中， 200 μL/孔，培养24 h，待细胞贴壁后换液，并加入含终浓度分别为0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 g/L 5-氟尿嘧啶的培养液，设对照孔（不含5-氟尿嘧啶）和空白孔（仅含四甲基偶氮唑盐），每孔体积均为100 μL，培养72 h 后，加入5 g/L 四甲基偶氮唑盐30 μL，继续培养4 h，弃上清后加入二甲亚酚100 μL，微量振荡器振荡10 min，酶联免疫分光仪490 nm 计数吸光度（A）值，抑制率(%)=1- [（A实验孔-A空白孔）/（A对照孔-A空白孔）]×100%，通过作图法，求出5-氟尿嘧啶对成纤维细胞半数抑制浓度（IC50值）。
流式细胞术分析法：将成纤维细胞接种于6孔板中，数目达到1×106/孔以上，并加入含终浓度分别为0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 g/L 5-氟尿嘧啶的培养液，设对照孔。培养 48 h 后，弃上清，胰酶消化，磷酸盐缓冲液清洗2遍。体积分数为0.75的乙醇l mL 悬浮细胞，固定，离心去上清。磷酸盐缓冲液清洗2遍后悬浮细胞，加人Rnase至终浓度25 mg/L，37 ℃，作用1 h，行细胞PI染色(PI液终浓度50~100 mg/L)，4℃ 避光染色，45 min 后上机。测量细胞凋亡率和细胞周期百分数。
成纤维细胞凋亡的形态观察：将成纤维细胞接种于预先铺好玻片的6孔细胞培养板中，调整细胞密度使细胞融合度约50%~80%为宜。

培养24 h后，加入含终浓度分别为0.2，0.3，0.4， 0.5，0.6 g/L 5-氟尿嘧啶的培养液，设对照孔，培养48 h 后，吸除培养液，加入2 mL 新鲜配制1∶3的冰醋酸/甲醇固定液，静置 15 min 后，吸除固定液。于各孔中加入0.2% Hoechst 33258染液2 mL，避光30 min 染色，吸掉染液，蒸馏水洗涤3次，吸干，翻转倒置在载玻片上，滴加柠檬酸缓冲液（pH 5.5）数滴封固，荧光显微镜观察凋亡细胞形态。
主要观察指标：①各浓度5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制率及半数抑制浓度（IC50）。②细胞凋亡率和细胞周期百分数。③细胞凋亡的形态。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0软件完成统计处理，实验数据以_x±s表示，数据经转换后采用配对t检验比较处理组与对照组以及各处理组间差别，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 瘢痕疙瘩成纤维细胞培养 6例手术切取的瘢痕疙瘩标本组织，原代培养成纤维细胞全部成活，形态正常。
2.2 四甲基偶氮唑盐法检测结果见表1。

经浓度分别为0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 g/L 5-氟尿嘧啶干预72 h 后，各组间两两比较差异均有显著性（P < 0.01）。通过作图求得半数抑制浓度IC50为（0.400±0.032）g/L，本实验再选用接近IC50的5个浓度：0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 g/L，作为余下实验浓度。
2.3 流式细胞仪检测结果以不同浓度0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 g/L 药物处理48 h 后，经流式细胞仪定量显示，细胞凋亡率分别为（4.160±0.370）%、(6.340±0.410)%、(10.020±0.720)%、(12.230±0.640)%、(14.340±0.860)%，组间两两比较差异有显著性意义（P < 0.05）；与对照组（0.400±0.013）%比较，差异均有显著性(P < 0.01)。与对照组细胞周期百分数比较，表现为G0/G1期停滞，S期减少。见表2。

2.4 Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡形态细胞凋亡过程中，早期细胞核呈波纹状或折缝样，部分染色质出现浓缩状态；中晚期凋亡细胞的核染色质高度凝集，边缘化，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体，见图1；对照组细胞内未见核浓缩，见图2。

5-氟脲嘧啶作为传统抗代谢药物，可抑制DNA合成，其诱导多种肿瘤细胞凋亡的作用已得到充分论证[8-9]。但5-氟尿嘧啶防止纤维化的机制尚不明确。
细胞凋亡是Kerr等[10]于1972年提出的，在维持机体内在平衡方面起非常重要的作用。人们推论在瘢痕的发生与创伤修复过程中，成纤维细胞正常程序性细胞死亡
机制的障碍是成纤维细胞增殖，分泌过多的胶原和细胞外基质，导致病理性瘢痕发生的重要机制。
笔者在实验中，通过四甲基偶氮唑盐比色法发现，5-氟尿嘧啶在体外对瘢痕疙瘩成纤维细胞有明显抑制作用（P < 0.01），且具有浓度依赖性。为准确观察细胞的凋亡和细胞周期变化，应选择能明显抑制增殖，同时对细胞毒性较小的浓度去干预瘢痕疙瘩成纤维细胞。即以接近IC50值[（0.400±0.032）g/L]的浓度，设计不同浓度（0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 g/L）。为了避免5-氟尿嘧啶长时间作用细胞后，坏死细胞增多，而影响细胞凋亡率的准确测定，笔者选用了干预48 h，流式细胞术定量显示，随药物浓度的增加，细胞凋亡率随之升高。
凋亡和坏死是细胞死亡的两种方式。凋亡是受基因调控、细胞主动参与且自身有一定程序的生理性死亡过程，又称程序性细胞死亡或细胞自杀。坏死是外界损伤因素直接破坏细胞的生物膜和能量代谢，导致细胞生命的被动中断。形态学的改变是判断凋亡或坏死的主要依据[11]。本实验Hoechst 33258荧光染色结果显示，不同浓度5-氟尿嘧啶干预48 h 后，荧光显微镜下观察成纤维细胞均发生不同程度凋亡，仅见很少量坏死细胞。说明在实验药物浓度下，细胞表现为凋亡而非坏死。通过四甲基偶氮唑盐比色法测得的细胞抑制率和流式细胞术检测的凋亡率有所差异，这可能是因为四甲基偶氮唑盐比色法检测的细胞抑制率包括细胞死亡和细胞增殖抑制两个方面，而细胞的死亡又包括许多凋亡细胞和极少数坏死细胞。因此，选用一个最佳浓度，既能抑制细胞增殖，同时又对细胞毒性较小的浓度，去观察细胞的凋亡和细胞周期变化甚为重要[12]。
研究认为，瘢痕疙瘩的形成与Bcl-2抑凋亡基因高表达密切相关[13]。降低瘢痕疙瘩中抑凋亡基因的高表达，可能是治疗瘢痕疙瘩的一种新的有效方法[14]。5-氟尿嘧啶对成纤维细胞有诱导凋亡的作用，其对相关凋亡基因作用通路有待于进一步研究[15]。
本实验中5-氟尿嘧啶干预成纤维细胞作用48 h 后，与对照组比较，实验组细胞周期百分数表现为G0/G1期停滞，S期减少（P < 0.05）。细胞周期的调节主要是通过一系列细胞周期因子的调控而实现。研究表明，细胞周期素D1和CDK4因子作为细胞分裂周期起始点G0/G1期的正性调节因子，可使细胞分裂加速。5-氟尿嘧啶对成纤维细胞的抑制作用可能直接或间接地与细胞周期素D1和CDK4基因的表达有关[16]。
总结近年来多数学者的研究发现[17-19]，5-氟尿嘧啶治疗瘢痕的主要作用机制可能有：①抑制成纤维细胞增殖。②降低成纤维细胞胶原合成和分泌能力。③诱导成纤维细胞凋亡。④抑制瘢痕内局部血管增生。但目前临床上应用5-氟尿嘧啶的方法和最佳浓度仍不确切。Fitzpatrick[20]曾对100多例瘢痕疙瘩患者病损内注射高浓度5-氟尿嘧啶（25 g/L），注射间隔期从每周二三次到每二三周1次，治疗效果较好。氟尿嘧啶可引起局部皮肤红斑、水肿、破溃、色素沉着。本实验应用较低浓度5-氟尿嘧啶干预体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞，可抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。并发现低浓度药物引起细胞坏死的比率较低，相应临床上局部副作用较少，且5-氟脲嘧啶价格低廉，采用低浓度、短周期注射5-氟尿嘧啶可能是治疗瘢痕疙瘩的一种新安全有效方法。其作用机制和临床应用方法仍有待于进一步研究。

1 Al-Attar A，Mess S，Thomassen JM，et al. Keloid pathogenesis and treatment. Plast Reconstr Surg 2006;117(1):286-300
2 Urioste SS，Arndt KA，Dover JS. Keloids and hypertrophic scars：review and treatment strategies. Semin Cutan Med Surg 1999；18(2):159-171
3 Sun Y，Wang LX，Wang L，et al. A comparison of the effectiveness of mitomycin C and 5-fluorouracil in the prevention of peridural adhesion after laminectomy. J Neurosurg Spine 2007；7(4)：423-428
4 Yildiz KH，Gezen F，Is M，et al. Mitomycin C，5-fluorouracil，and cyclosporin A prevent epidural fibrosis in an experimental laminectomy model. Eur Spine J 2007;16(9):1525-1530
5 Wojtulewicz M，Rekas M，Wierzbowska J. Subconjuctival application of 5-fluorouracil (5-FU) following surgical treatment of glaucoma with deep sclerectomy-indications，complications and initial evaluation of effectiveness. Klin Oczna 2005;107(4-6):232-235
6 Viveiros MM，Schellini SA，Candeias J，et al. Exposure of normal Tenon's capsule fibroblasts from pterygium to 5-fluorouracil and mitomycin C. Arq Bras Oftalmol 2007;70(1):73-77
7 Roseborough IE，Grevious MA，Lee RC. Prevention and treatment of excessive dermal scarring. J Natl Med Assoc 2004;96(1):108-116
8 Matsuhashi N，Saio M，Matsuo A，et al. Apoptosis induced by 5-fluorouracil, cisplatin and paclitaxel are associated with p53 gene status in gastric cancer cell lines. Int J Oncol 2005;26(6):1563-1567
9 Ocker M，Alajati A，Ganslmayer M，et al. The histone-deacetylase inhibitor SAHA potentiates proapoptotic effects of 5-fluorouracil and irinotecan in hepatoma cells. J Cancer Res Clin Oncol 2005;131(6):385-394
10 Kerr JF，Wyllie AH，Currie AR. Apoptosis：a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972；26(4)：239-257
11 成军.程序性细胞死亡与疾病[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1996:1-2
12 Wendling J，Marchand A，Mauviel A，et al. 5-fluorouracil blocks transforming growth factor-beta-induced alpha 2 type I collagen gene (COL1A2) expression in human fibroblasts via c-Jun NH2-terminal kinase/activator protein-1 activation. Mol Pharmacol 2003;64(3):707-713
13 Sayah DN, Soo C, Shaw WW, et al. Downregulation of apoptosis-related genes in keloid tissues. J Surg Res 1999; 87(2):209-216
14 Ladin DA，Hou Z，Patel D，et al. P p53 and apoptosis alterations in keloids and keloid fibroblasts. Wound Repair Regen 1998；6(1)：28-37
15 Liu Y,Ren LS,Cen Y. Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi 2001;15(6):351-353
刘勇，任林森，岑瑛.Bcl-2和Fas基因在瘢痕成纤维细胞中的表达[J].中国修复重建外科杂志,2001,15(6):351-353
16 Kojiro S，Yano H，Ogasawara S，et al. Antiproliferative effects of 5-fluorouracil and interferon-alpha in combination on a hepatocellular carcinoma cell line in vitro and in vivo. J Gastroenterol Hepatol 2006;21(1 Pt 1):129-137
17 Bulstrode NW，Mudera V，McGrouther DA，et al. 5-fluorouracil selectively inhibits collagen synthesis. Plast Reconstr Surg 2005;116(1):209-221;discussion 222-223
18 Gong YY，Li XJ，Wang ML，et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu Yu Linchuang Kangfu 2007;11(6):1060-1063
龚轶一，李小静，王明丽，等.成纤维细胞分泌胶原蛋白与5-氟尿嘧啶的时间抑制效应[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(6):1060-1063
19 Wu XL，Liu W，Cao YL. Zhonghua Zhengxing Waike Zazhi 2006;22(1):44-46
武晓莉，刘伟，曹谊林.低浓度5-氟尿嘧啶抑制血管增生在瘢痕疙瘩综合治疗中的作用初探[J].中华整形外科杂志,2006,22(1):44-46
20 Fitzpatrick RE. Treatment of inflamed hypertrophic scars using intralesional 5-FU. Dermatol Surg 1999;25(3):224-232