钙通道阻滞剂对体外培养神经瘢痕成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响☆

薛金伟1，姜志刚2，杨光1，李锐1，尹维田1

课题背景：近年来研究发现，钙通道阻滞剂可以通过调节细胞内外Ca2+离子的浓度来影响细胞外基质的合成和代谢过程，尤其是影响胶原的合成和分泌，临床用于纤维化疾病、硬皮病、增生性瘢痕及术后粘连等细胞外基质代谢异常疾病的预防和治疗获得良好效果。同时在神经再生研究领域，瘢痕对神经功能的影响越来越受到人们的重视，神经卡压综合征、神经损伤后瘢痕形成过程都出现细胞外基质的代谢异常。本实验则从减轻神经瘢痕，改善再生环境角度研究神经再生的抑制因素，希望成为研究神经再生的又一切入点。

应用要点：本实验从减轻神经瘢痕，改善再生环境的角度探讨了神经再生的抑制因素，这是本实验理论上有别于其他观点的地方。另外，实验应用钙通道阻滞剂作用于神经瘢痕，把瘢痕的模型和神经再生的模型交叉应用于神经瘢痕的实验中，为周围神经修复的研究提供了新的途径。

同行评价：该文观察钙通道阻滞剂维拉帕米对体外培养神经瘢痕成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响，具有一定的新颖性，得出了较好的结果。��

1吉林大学中日联谊医院手外科，吉林省长春市 130033；2长春市中心医院骨二科，吉林省长春市 130021

薛金伟☆，男，1978年生，河北省保定市人，汉族，吉林大学中日联谊医院在读博士，工作单位：河北大学附属医院骨科，主要从事骨与关节损伤、周围神经损伤与再生的相关研究。
xuexueisen@sohu.
com

通讯作者：尹维田，教授，博士生导师，吉林大学中日联谊医院，吉林省长春市
130033

摘要
目的:钙通道阻滞剂可抑制瘢痕成纤维细胞的增殖及胶原蛋白的分泌，减少瘢痕的增生。实验拟进一步观察钙通道阻滞剂对体外培养神经瘢痕成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响。
方法：实验于2006-03/06在吉林大学中日联谊医院中心实验室完成。①实验材料：Wistar大鼠10只；盐酸维拉帕米注射液为上海禾丰制药有限公司产品。②实验过程及分组：制作大鼠双侧坐骨神经损伤模型，术后2周取损伤处神经瘢痕，按组织块法培养神经瘢痕成纤维细胞，实验所用细胞为4~8代，分4组，其中3组培养基中维拉帕米药物浓度分别为10，50及100 μmol/L，1组为空白对照组。③实验评估：分别用四甲基偶氮唑盐法观察细胞增殖能力、羟脯氨酸比色法测定细胞上清液中的胶原含量和胞浆中的胶原含量。
结果：①四甲基偶氮唑盐法观察细胞增殖结果：钙通道阻滞剂对神经瘢痕成纤维细胞的生长增殖具有明显抑制作用，且呈现剂量依赖性(P < 0.05)。②羟脯氨酸比色法测定胶原含量：钙通道阻滞剂可使分泌到细胞培养上清中的胶原含量明显减少，以100 μmol/L浓度组作用最为显著(P < 0.05);胞浆中的胶原含量增加，具有明显剂量依赖性，以100μmol/L浓度组作用最为显著（P < 0.05）。
结论：钙通道阻滞剂可以抑制神经瘢痕成纤维细胞的增殖及胶原分泌。
关键词：神经瘢痕；钙通道阻滞药；维拉帕米；成纤维细胞；胶原；组织构建

薛金伟，姜志刚，杨光，李锐，尹维田. 钙通道阻滞剂对体外培养神经瘢痕成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响 [J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(7):1239-1242 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1239(ps).pdf]

中图分类号:R681.9
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)07-01239-04

Effects of calcium channel blocking agent on fibroblast proliferation and collagen synthesis in nerve scars cultured in vitro

AIM:Calcium channel blocking agent can inhibit the proliferation of scar-derived fibroblasts and synthesis of collagen, and inhibit the formation of hypertrophic scar. This study observed the effect of calcium channel blocking agent on fibroblast proliferation and collagen secretion of nerve scars cultured in vitro.
METHODS: The experiment was performed at the Central Laboratory of China-Japan Union Hospital of Jinlin University from March to June 2006. ①Ten Wistar rats were made into models of bilateral sciatic nerve injury. Two weeks after modeling, injured nerve scars were obtained and fibroblasts were cultivated according to tissue culture method. The cells of the fourth to eighth passage were selected and divided into 4 groups. In 3 Verapamil groups, cells were cultured in culture medium containing 10, 50 and 100 μmol/L Verapamil (Shanghai Harvest Pharmaceutical Co., Ltd.). ②Cell proliferative activity was investigated by MTT method and the collagen content in supernatant fluid of cell and endochylema were examined by hydroxyproline colorimetric analysis.
RESULTS: ①Calcium channel blocking agent could significantly inhibit the growth and proliferation of fibroblasts in a dose dependent manner (P < 0.05). ②Calcium channel blocking agent remarkably decrease collagen content in supernatant of cell culture but increase collagen content in endochylema in a dose dependent manner, especially in 100 μmol/L group (P < 0.05).
CONCLUSION: Calcium channel blocking agent can inhibit fibroblast proliferation and collagen secretion of nerve scars.

Xue JW, Jiang ZG, Yang G, Li R, Yin WT. Effects of calcium channel blocking agent on fibroblast proliferation and collagen synthesis in nerve scars cultured in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(7):1239-1242(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1239(ps).pdf]

近年来研究表明，钙通道阻滞剂（维拉帕米）对一些纤维化疾病，如肺纤维化[1-2]、硬皮病[3-4]、增生性瘢痕及术后粘连均有良好治疗作用[5-11]，但其对神经组织损伤后神经瘢痕形成有无抑制作用尚无相关报道。本实验应用钙通道阻滞剂（维拉帕米）作用于体外培养的神经瘢痕成纤维细胞，观察其对神经瘢痕成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响。

设计：完全随机分组设计，对照实验。
单位：吉林大学中日联谊医院。
材料：实验于2006-03/06在吉林大学中日联谊医院中心实验室（BSL-1）完成，清洁级Wistar大鼠10只由吉林大学基础医学院实验动物中心提供（合格证号：SCXK-J2003-2001）。盐酸维拉帕米注射液为上海禾丰制药有限公司产品；DMEM、胰蛋白酶为美国Gibco公司产品；标准胎牛血清购自天津灏洋公司；四甲基偶氮唑盐、二甲基亚砜由美国Sigma公司提供；羟脯氨酸测试盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预实施评估为全部作者，均受过专业培训，未采用盲法评估。
技术路线：
神经瘢痕造模、体外培养：将大鼠用100 g/L水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后，无菌条件下显露大鼠双侧坐骨神经，切断并用9-0无损伤尼龙线缝合神经外膜5~7针，关闭切口并于术后2周无菌条件下取损伤处神经瘢痕，经漂洗、剪碎，培养于体积分数为0.2的胎牛血清的DMEM培养液中，置37 ℃，体积分数为0.05的CO2孵箱中按组织块法培养[12]，待长成致密单层后用2.5 g/L 胰蛋白酶消化，以1∶3传代，本实验所用细胞为4~8代。
神经瘢痕成纤维细胞实验分组及药物处理：将4~8代对数生长期的神经瘢痕成纤维细胞用2.5 g/L 胰酶消化，制成细胞悬液，调整浓度为5×107 L-1接种于6孔和96孔细胞培养板中，培养细胞分4组，每组12个复孔，其中3组培养基中维拉帕米药物浓度分别为10，50及 100μmol/L[13-15]，1组为空白对照组。
四甲基偶氮唑盐法观察细胞增殖：将4~8代处于对数生长期的神经瘢痕成纤维细胞接种于96孔板，每孔5×103个细胞，CO2孵箱中培养8 h，待细胞贴壁、伸展后按分组加入条件培养液。48 h后每孔弃去上清10 μL，加入10 μL四甲基偶氮唑盐溶液(5 g/L)，CO2孵箱培养3 h，吸弃培养液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min，490 nm波长，酶联免疫分析仪测吸光度(A)。
羟脯氨酸比色法测定胶原含量：
测定细胞上清液中的胶原含量：取4~8代对数生长期的神经瘢痕成纤维细胞，调整浓度为5×107 L-1，并接种于6孔细胞培养板中，37 ℃孵箱培养7 d，待细胞接近融合时，按实验分组加入条件培养液。48 h 后取培养液上清50 μL于玻璃试管中，按羟脯氨酸测定试剂盒说明书方法，用722光栅分光光度计于550 nm 波长测定吸光度A，并计算细胞上清中胶原蛋白含量。
测定胞浆中的胶原含量：将上步骤取完培养液上清的细胞分别用2.5 g/L 胰酶消化制成细胞悬液，2 000 r/min 离心10 min，将细胞收
集于离心管中，弃上清，反复冻融法提取细胞内蛋白，同法于550 nm 波长测定吸光度(A)，并计算细胞内胶原蛋白含量。
主要观察指标：①四甲基偶氮唑盐法观察细胞增殖。②羟脯氨酸比色法测定细胞上清液中和胞浆中的胶原含量。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 13.0统计分析软件对所得数据进行统计学分析，比较采用成组t检验，P < 0.05为差异具有显著性意义。

2.1 四甲基偶氮唑盐法观察细胞增殖维拉帕米对神经瘢痕成纤维细胞的生长增殖具有抑制作用，且呈现明显剂量依赖性（P < 0.05），见图1。

细胞上清液中的胶原含量：维拉帕米可使分泌到细胞培养上清中的胶原含量明显减少，以100 μmol/L 浓度组作用最为显著（P < 0.05）。
胞浆中的胶原含量：随着维拉帕米浓度的增加，细胞胞浆中胶原的含量明显增多，以100 μmol/L 浓度组作用最为显著（P < 0.05）。

周围神经损伤后的修复无疑是显微外科的一道难题，影响其功能恢复的因素是多方面的，其中最常见的抑制因素是神经吻合口胶原纤维增生所形成的创伤性神经瘢痕[16]，它在神经束内会形成物理性屏障，阻碍轴索的延伸[17]；在神经系膜及外膜则形成组织粘连，阻碍神经正常滑动，当肢体运动带动神经滑动时，局部粘连及神经纤维波浪状结构的丧失，又会使神经伸展能力降低，这样纵向的拉力集中于损伤局部转化成垂直于神经干的环向压力，造成机械性卡压阻断神经血运及轴突的运输，导致髓鞘变性、轴突断裂，影响神经功能恢复[18]。可见，减轻及软化神经瘢痕，降低粘连，就能在很大程度上改善神经的恢复情况。因此抑制神经瘢痕的研究也越来越受到人们的重视[19]。
钙通道阻滞剂（维拉帕米）在治疗其他组织的瘢痕和纤维化疾病的研究中已经取得了可喜的进展，Yin等[1]用于肺纤维化的治疗，Rehman等[20]用于治疗阴茎硬化纤维病，均取得了良好效果。Steinleitner等[21]通过动物实验发现钙通道阻滞剂对腹部手术后粘连有预防作用。国内王臻[13]、张立等[10]分别用于对增生性瘢痕和瘢痕疙瘩治疗的研究，也取得了可喜的结果。那么维拉帕米对神经瘢痕的形成过程有无抑制作用呢？本实验体外培养神经瘢痕成纤维细胞，并观察了维拉帕米对其生长增殖及胶原分泌的影响。
四甲基偶氮唑盐法是目前常用的检测细胞增殖和活力的方法，在研究中广泛应用。本实验观察到维拉帕米对神经瘢痕成纤维细胞的生长增殖具有抑制作用，且呈现明显剂量依赖性，这与Lee等[22]的实验结果相一致。羟脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸，含量相对恒定，占胶原中总氨基酸的13.4%，而其他蛋白质含量极微，故羟脯氨酸的测定值可间接反映胶原蛋白的合成和分泌情况[23]。本实验应用羟脯氨酸比色法分别对细胞培养上清和细胞胞浆中的胶原含量进行测定，结果表明随着药物剂量的增加，维拉帕米可使分泌到细胞培养上清中的胶原含量明显减少，而胞浆中的胶原含量却反而上升，其效应具有明显剂量依赖性，以100 μmol/L 浓度组作用最为显著，实验结果提示维拉帕米能够抑制神经瘢痕成纤维细胞分泌胶原蛋白到细胞外，但对于胞浆中的胶原含量增加，本实验无直接证据证明是胶原蛋白合成增多所致，还是分泌减少蓄积在胞浆中所致。Diegelmann等[24]发现钙通道阻滞剂能够破坏细胞骨架，阻断高尔基体来源的囊泡移动，结果导致细胞内原胶原增加。Lee等[22]和Roth等[25-26]研究发现维拉帕米能抑制胶原蛋白等大分子分泌到细胞外，蓄积在细胞内的胶原蛋白又反馈性的抑制了原胶原基因的转录，从而减少了胶原蛋白的生成。从本实验结果分析，作者比较支持这种观点，也将对其进一步研究。
综上所述，钙通道阻滞剂（维拉帕米）可以抑制神经瘢痕成纤维细胞的增殖及胶原蛋白的分泌，很可能对神经瘢痕具有预防和治疗作用。

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