降钙素受体基因多态性与原发性骨质疏松的相关性★
栾军伟，陈晓亮，袁百胜，周政纲
课题背景：降钙素是人体调节钙代谢和骨转换的重要激素，降钙素受体在骨骼中主要分布在破骨细胞及其前体细胞上，调节体内骨代谢和维持。本试验通过聚合酶链反应－限制性长度多态性技术分析胶东半岛汉族人群降钙素受体各基因型分布频率，进一步探讨各基因型与骨密度的关系及其多态性与骨质疏松性骨折的相关性。
应用要点：试验结果提示人群降钙素受体基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg 定律。胶东半岛受试人群基因型频率分布依次为CC型，CT型，TT型。降钙素受体C1377T基因多态性可能成为胶东半岛汉族女性发生骨质疏松危险性的遗传标志。
相关链接：对降钙素受体基因多态性与骨密度关系的研究在国际上开始引起重视。尽管国内外进行了大量的相关性研究，但是由于存在种族及环境等多方面的影响，降钙素受体基因及其多态性在骨质疏松的病理机制中所起的作用并未取得共识。���
青岛大学医学院附属医院脊柱外科，山东省青岛市
266003
栾军伟★，男，1975年生，山东省胶州市人，汉族，青岛大学医学院附属医院骨科在读硕士，住院医师，主要从事基因多态性与骨质疏松相关性的研究。
ljw_003@hotmail.com
通讯作者：陈晓亮，教授，主任医师，硕士生导师，青岛大学医学院附属医院脊柱外科，山东省青岛市 266003
摘要
目的:骨质疏松是多基因调控疾病，峰值骨量达到和骨量丢失均受遗传因素影响。观察山东半岛地区汉族人群降钙素受体Alu-Ⅰ基因多态性各基因型频率及其与骨质疏松的关系，探讨原发性骨质疏松症的遗传易感因素。
方法：试验于2005-06/2007-06在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①试验对象：选取332名长期居住在山东半岛地区无亲缘关系的汉族人群，纳入标准：健康门诊查体人员、原发性骨质疏松症及原发性骨质疏松症所致骨折患者；患者对试验知情同意。排除标准：各种继发性骨质疏松症；影响骨代谢相关疾病史；服用影响骨代谢药物等。其中骨质疏松合并骨折75例作为骨质疏松性骨折组，余257例经过骨密度测定确定骨量，按骨质疏松诊断标准（骨密度测定值比同性别峰值骨密度均值降低2.5个标准差）分为骨量正常组（n =201）及骨质疏松组（n =56）。②试验方法：应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析技术测定257名山东半岛汉族成年人和75名骨质疏松性骨折患者降钙素受体基因型，用双能X射线吸收法测定腰椎、股骨颈、粗隆间、Ward’s三角和大转子区等部位的骨密度值。
结果：纳入受试者332人，均进入结果分析。①本试验人群降钙素受体基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg 定律(χ2=0.47，P =0.493)。基因型频率分布依次为CC型占89.5%，CT型占10.5%，TT型占0%。②年龄与不同部位骨密度值之间呈负相关（P < 0.01），体质量指数与骨密度值之间呈正相关（P < 0.01），在将年龄和体质量指数进行校正后发现女性CC基因型较CT基因型在ward’s三角区有较高的骨密度（P < 0.05)，骨量正常组各基因型与骨质疏松性骨折组之间差异无显著性意义（P > 0.05)。
结论：山东半岛汉族女性降钙素受体基因型与骨密度之间存在一定关联，降钙素受体C1377T基因多态性可能成为胶东半岛汉族女性发生骨质疏松危险性的遗传标志。
关键词：降钙素受体；基因多态性；骨密度；骨质疏松；组织构建
栾军伟，陈晓亮，袁百胜，周政纲.降钙素受体基因多态性与原发性骨质疏松的相关性[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(7):1243-1246 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1243(ps).pdf]
中图分类号:R681.4
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)07-01243-04
收稿日期：2007-09-07 修回日期：2007-10-26 (07-50-9-4894/WL·A）
Association between calcitonin receptor gene polymorphism and primary osteoporosis
Abstract
AIM:Osteoporosis is a polygenic disease, and the peak bone mass and bone mass loss are significantly determined by genetic factors. The study determined the genotype frequencies of calcitonin receptor Alu Ⅰ gene polymorphism and its association with osteoporosis in Shandong peninsula Han populations, so as to explore the predisposing factor for osteoporosis in heredity.
METHODS: The experiment was conducted in the central laboratory of Affiliated Hospital of Qingdao Medical College from June 2005 to June 2007. ①332 Han people from unrelated families who lived in Shandong peninsula for many years were selected. Those with healthy physical examination personnel from health clinic, primary osteoporosis and primary osteoporotic fracture were enrolled, and the informed consents were obtained from all the participants. All people with various secondary osteoporosis, bone metabolism disease, and drugs that had influence on bone metabolism were excluded. People with osteoporosis complicated by fracture served as osteoporotic fracture group (n =75), and the rest were divided into normal bone mass group (n =201) and osteoporosis group (n =56) according to the body mass (bone densitometry was 2.5 standard deviation lower than peak bone density of the same sex). ②Alu Ⅰ polymorphism of calcitonin receptor gene was tested by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) in 257 adults and 75 patients with osteoporotic fracture. The bone mineral density of lumbar spine (L2-4), intertroch, femoral neck, Ward's triangle area and greater trochanter were measured by dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA).
RESULTS: 332 subjects were all involved in the result analysis. ①The frequencies distribution of Alu Ⅰ alleles and genotypes in this cohort were accorded with Hardy-Weinberg equilibrium (χ2 =0.47, P =0.493). The frequency distribution of genotypes CC, CT and TT were 89.5%, 10.5% and 0%. ②Age showed significant negative correlation with bone mineral density (P < 0.01), and body mass index had significant positive correlation with bone mineral density (P < 0.01). The bone mineral density in Ward's triangle of women with CC genotype was significant higher compared with CT genotype (P < 0.05) after the body mass index and age were corrected. There was no significant difference between osteoporotic fracture group and normal control group (P > 0.05).
CONCLUSION: There is a possible correlation between calcitonin receptor gene polymorphisms and bone mineral density in Han female of Shandong peninsula. C1377T gene polymorphism may act as the genetic marker in predicting the risk factor for osteoporosis.
Luan JW, Chen XL, Yuan BS, Zhou ZG.Association between calcitonin receptor gene polymorphism and primary osteoporosis.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(7):1243-1246(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1243(ps).pdf]
0 引言
骨质疏松症是最常见的骨代谢疾病，家系[1]及双胞胎研究表明骨质疏松症是多基因调控、强遗传性的疾病。自1994年Morrison等[2]首次揭示维生素D受体与骨密度有关联以来，影响骨密度的基因多态性与骨密度及骨折关系的研究逐渐深入，如Ⅰ型胶原基因[3]、低密度脂蛋白受体相关蛋白基因[4]及大麻素受体基因[5-6]等。
降钙素是人体调节钙代谢和骨转换的重要激素，降钙素受体在骨骼中主要分布在破骨细胞及其前体细胞上，调节体内骨代谢和维持。对降钙素受体基因多态性与骨密度关系的研究在国际上开始引起重视。尽管国内外进行了大量的相关性研究，但是由于存在种族及环境等多方面的影响，降钙素受体基因及其多态性在骨质疏松的病理机制中所起的作用并未取得共识。
本试验通过聚合酶链反应-限制性长度多态性技术分析胶东半岛汉族人群降钙素受体各基因型分布频率，进一步探讨各基因型与骨密度的关系及其多态性与骨质疏松性骨折的相关性。
1 对象和方法
设计：随机对照观察。
单位：青岛大学医学院附属医院。
对象：试验于2005-06/2007-06在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。选取长期居住在山东半岛地区无亲缘关系的汉族人群，入选对象均进行详细的体检、检查肝肾功能、血钾、钠、氯、钙和磷水平；甲状腺功能、血甲状旁腺激素水平。并经调查问卷排除影响骨代谢的药物：如雌激素、降钙素、二膦酸盐、维生素D 和氟化物等。纳入标准：健康门诊查体人员、原发性骨质疏松症及原发性骨质疏松症所致骨折；患者对试验知情同意。排除标准：各种继发性骨质疏松症；影响骨代谢相关疾病史；服用影响骨代谢药物等。选择骨质疏松合并骨折75例作为骨质疏松性骨折组，257例经过骨密度测定确定骨量，按骨质疏松诊断标准（骨密度测定值比同性别峰值骨密度均值降低2.5个标准差）分为骨量正常组（n =201）及骨质疏松组（n =56）。
设计、实施、评估者：试验设计、干预实施及评估均为第一、二作者，受过正规培训，采用盲法评估。
方法：
干预措施：所有试验对象均抽取清晨空腹外周静脉血5 mL，其中3 mL 置于普通试管中以测定血钙、磷、碱性磷酸酶、血糖等生化指标，另外2 mL 置于无菌无酶的EDTA抗凝的试管中-20 ℃ 保存。227名受试者经过双能X射线骨密度仪（GE LUNAR DPX-NT，USA）检测腰椎、股骨颈、ward’s三角、大转子、股骨干等部位骨密度值。采用promega公司提供的DNA抽取盒（A1120）抽体外周血DNA。以2 μL DNA为模板通过PCR扩增目的片段。引物[10]分别为上游：TTC AGT GGA ACC AGC GTT GG；下游：CTC AGT GTA CAC GAT ACT GTG(由上海生物工程技术有限公司合成)。反应条件：94 ℃ 预变性3 min，94 ℃ 变性45 s，57 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸40 s，35个循环，72 ℃ 再延伸10 min。扩增产物片断为228 bp。经1.5%的琼脂糖凝胶电泳确认扩增结果后，继以ALU-Ⅰ限制性内切酶37 ℃ 酶切PCR产物16 h。最后用3%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物片断。溴化乙锭染色，紫外灯下观察。无ALU-Ⅰ酶切位点的CC纯合子显示228 bp 1条带，有ALU-Ⅰ酶切位点的TT纯合子显示120 bp、108 bp 2条带。CT型杂合子显示228 bp、120 bp、108 bp 3条带。
主要观察指标：各组降钙素受体基因型分布频率及对应骨密度值。
统计学方法：由第一作者采用基因计数法分别统计各组基因型和等位基因频率，数据经Hardy-weinberg 平衡检验后，用SPSS 11.5统计软件分析，计量资料以_x±s表示，用Pearson相关分析年龄及体质量指数与骨密度的关系，用协方差分析的方法比较年龄、身高、体质量校正后各部位骨密度和降钙素受体基因型之间的关系；频率分布及骨质疏松性骨折组患者与骨量正常人群基因型分析采用χ2检验。P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。
2 结果
2.1 参与者数量分析 纳入长期居住在山东半岛地区无亲缘关系的汉族受试者332人，均进入结果分析，无脱落。
2.2 降钙素受体基因型分布 降钙素受体基因ALU-Ⅰ酶切位点多态性确定为：C表示不存在相应酶切位点，T表示存在相应酶切位点，因而对应的基因型有3种：CC型（终产物只有228 bp 1条带）；CT型（杂合子，终产物为228 bp、120 bp、108 bp 3条带）（见图1）。选取15份PCR产物测序，均符合上述酶切结果。基因型与等位基因分布频率见表1。经HWE软件检验降钙素受体各基因型及等位基因频率分布，均符合Hardy- Weinberg 定律(χ2=0.47，P =0.493)。
2.3 受试者体质量指数、年龄与各部位骨密度的相关性分析 见表2。
对各部位骨密度值与年龄、体质量指数的回归分析发现，年龄与各部位的骨密度呈负相关（P < 0.01）；体质量指数与骨密度值呈正相关（P < 0.01）。说明年龄与体质量指数均影响不同部位骨密度值。
2.4 受试者年龄、体质量指数较正后各部位骨密度值与降钙素基因型的相关性 见表3。
在分别对年龄、体质量、年龄与体质量进行较正后，ward’s 三角部位的骨密度值与各基因型相关，女性CC基因型较CT基因型在ward’s三角区有较高的骨密度（P < 0.05），不同部位的CC型骨密度值均大于CT 型。
2.5 骨质疏松性骨折组和骨量正常组基因频率比较 见表4。
对75名骨质疏松性骨折与骨密度正常受试个体的基因型频率进行分析，认为骨质疏松性骨折的发生在不同基因型间差异无显著性意义（P > 0.05）。
3 讨论
降钙素受体基因定位于人染色体7q21.3[7]。在扫描人类降钙素受体基因时发现11个多态性位点，其中10个位点存在单核苷酸多态性(SNP)突变，其中两个SNP在基因编码区内，而这其中一个位点存在氨基酸的突变[8]。现证明其核苷酸序列1 377处的C突变为T，导致相应的蛋白结构中脯氨酸(CCG)突变为亮氨酸(CTG)，从而使降钙素受体基因产生CC(纯脯氨酸)、TT(纯亮氨酸)、CT (脯氨酸、亮氨酸杂交型) 3种基因型。该单核苷酸突变影响到其与配体的结合并改变了受体信号转导的特性，从而影响了靶细胞对降钙素的反应。
1997年Nakamura等[9]对152名16~43岁日本女性进行研究，解释了在日本人群中Alu-Ⅰ降钙素受体的多态性，认为骨密度在3个基因型间无差异。1998年Masi等[10]分析了201名47~76岁绝经后的意大利妇女这种多态性分布，结果与日本人相反：CC基因型与TT基因型相比在腰椎有明显高的骨密度。Tsai等[11]对167名绝经后女性研究中发现TT型与低骨量有关。Bandres等[12]和波兰的Drews等[13]的研究与高加索人群相似，与亚洲人不同。国内对汉族人各基因型对骨密度影响的研究亦存在分歧，2002年章振林等[14]对北京地区汉族妇女的研究中发现，降钙素受体基因型与峰值骨量的达到和维持有关，但其同时指出，降钙素受体基因型不能作为预测中国汉族妇女发生骨质疏松危险性的遗传学标志。崔学文等[15]对303名山东妇女研究结果显示基因分布频率CC、TT、CT型分别为100%、0、0。王琦等[16]对测定夏河县藏族人群的降钙素受体基因单核苷酸多态性，发现藏族的降钙素受体基因型通过影响峰值骨量的获得成为影响骨质疏松发生的危险因素。许明慧等[17]在对河北汉族女性的研究中发现CT型腰椎骨密度有降低的趋势。李东风等[18]对广州地区汉族绝经后女性研究中发现3种基因型的骨密度值之间差异无显著性意义。李东风等[19]又对年龄≥65岁广州地区汉族男性进行研究，认为降钙素基因C1377T基因多态性尚不能作为预测汉族老年男性发生骨质疏松危险性的遗传标志。这些研究进一步证实了降钙素受体的基因多态性分布频率存在种族差异性，已报道的高加索人和意大利人与日本人和中国汉族人的基因型分布显著不同。
本试验表明山东半岛降钙素受体C1377T多态性各基因型分布频率与北京、上海、广州等地基因型分布频率相似，与泰安地区及高加索人种分布频率显著不同。在各基因型与骨密度关系方面，CT型各部位骨密度值均小于CC基因型，年龄与骨密度值呈显著负相关，随着年龄的增加，骨密度逐渐降低，而体质量指数与骨密度呈显著正相关。本试验在对各部位骨密度值分析时运用协方差分析，将这些影响因素齐同后分别对不同性别受试者进行分析，发现女性受试者CT型在ward’s三角骨密度值明显低于CC型，差异具有显著性意义（P < 0.05）；而男性组的研究却未发现存在关联。这一结果与Masi等[10]和Tsai等[11]研究结果相似，表明山东半岛汉族女性CT基因型ward’s三角区域具有较低骨密度，CT基因型可能成为胶东半岛汉族妇女发生骨质疏松危险性的遗传标志。骨质疏松的直接后果是骨折，所以骨质疏松骨折也是合理的遗传表型，虽然在对骨质疏松骨折和骨密度正常人群基因型相关分析中并未发现有显著差异，但该组CT基因型骨折发生率远大于CC型。不同统计结果的差异可能与统计方法的不同及样本量大小有关。本试验结果提示，有必要对山东半岛汉族女性进行更大规模的研究以进一步明确降钙素受体Alu-Ⅰ基因多态性与骨密度及骨质疏松性骨折的关系。为临床早期筛选骨质疏松或骨折的高危人群提供遗传学依据，利于早期的有效防治。
已经发表的遗传学研究结果不一致，其原因可能是尽管侯选位点的关联分析具有很强的统计功效，但易导致假阴性和假阳性结果。降钙素受体基因多态性的分布、基因的表达及对骨密度的作用受种族、生活环境、研究方法及样本量大小等因素的影响。因此，降钙素基因多态性与骨质疏松相互关系还需要进行多中心、大样本的研究，并综合考虑诸多因素的协同作用。
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