激活Hacat细胞表面Toll样受体促进创面愈合的机制★

韩勇彬，胡大海，杨崇志，蔡维霞，白晓智，胡晓龙

课题背景：表皮角质形成细胞是皮肤创面愈合的主要修复细胞之一，创面愈合过程中表皮角质形成细胞增殖、迁移和分化，最终完成再上皮化过程。激活一些细胞的Toll样受体可以促进细胞的增殖。实验通过检测激活表皮角质形成细胞表面Toll样受体后对创面愈合的影响，对其促进创面愈合的机制作初步探讨。

偏倚或不足：实验只是课题研究的初级阶段，关于激活Toll样受体促进创面愈合的研究国内外均少见，主要集中于Toll样受体与炎症反应的关系，促进创面愈合是一个复杂的过程，可能涉及到多个信号转导通路，对组织再生的影响也是多方面的，这方面的机制仍不清楚，需进一步研究才能明确。

术语解析：Toll样受体家族属于白细胞介素1受体/ Toll样受体超家族，主要分布于免疫细胞以及同外界相通的腔道上皮细胞表面，在巨噬细胞、树突状细胞等专职抗原提呈细胞表面的表达尤其丰富。不同的Toll样受体分子识别不同的病原体相关分子模式，其配体几乎涵盖了人类所能遇到的所有病原体及其产物，从而赋予人类先天性抵抗感染的能力。

解放军第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科，陕西省西安市
710032

韩勇彬★，男，1979年生，山西省临汾市人，汉族，解放军第四军医大学西京医院烧伤科在读硕士，主要从事创面愈合的研究。
yongbinh@yahoo. com.cn

通讯作者：胡大海，教授，博士生导师，解放军第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科，陕西省西安市 710032
burns@fmmu.edu.cn

摘要
目的:细胞表面Toll样受体对激发先天性免疫、抵抗微生物感染有重要作用。最近研究发现激活细胞表面Toll样受体不仅可以预防微生物感染，还可以促进组织再生。实验通过脂多糖激活体外培养的角质细胞株Hacat细胞表面Toll样受体，观察其促进创面愈合的可能机制。
方法：实验于2007-07在解放军第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科完成。①实验分组及方法：角质细胞株Hacat由解放军第四军医大学西京医院皮肤科馈赠；脂多糖为Sigma公司产品；小鼠抗人Toll样受体2单克隆抗体、兔抗人Toll样受体4多克隆抗体购于ebioscience公司。体外培养Hacat细胞，根据脂多糖(500 ng/L)与Hacat细胞共培养24，48，72 h将细胞随机分为脂多糖作用24 h 组、脂多糖作用48 h 组、脂多糖作用72 h 组，另设对照组，只加溶剂二甲基亚枫。②实验评估：蛋白免疫印迹技术检测脂多糖对Hacat细胞Toll样受体2、Toll样受体4及核因子-κB表达的影响；荧光定量聚合酶链反应检测脂多糖作用后Hacat细胞内基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子的表达。
结果：光学显微镜下正常人皮肤表皮及角质细胞Toll样受体2、Toll样受体4表达呈蓝黑色；脂多糖作用于Hacat细胞24，48，72 h 后Toll样受体2、Toll样受体4、核因子-κB表达均高于对照组（P < 0.01）。与对照组相比，其他3组基质金属蛋白酶3及血管内皮生长因子表达均增高（P < 0.01，P < 0.05）。脂多糖作用24 h 组基质金属蛋白酶9表达与对照组差异无显著性（P > 0.05），脂多糖作用48，72 h 组与对照组比较，差异显著（P < 0.05）。
结论：激活Hacat细胞表面Toll样受体有促进创面愈合作用，其机制可能与脂多糖作用于Toll样受体从而激活核因子-κB信号传导通路促进细胞释放基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子等因素有关。
关键词：Hacat细胞；Toll样受体；创面愈合；组织构建

韩勇彬，胡大海，杨崇志，蔡维霞，白晓智，胡晓龙. 激活Hacat细胞表面Toll样受体促进创面愈合的机制[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(7):1272-1276 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1272(ps).pdf]

Mechanism of active Toll-like receptors on the surface of Hacat cells to promote wound healing

AIM:Toll-like receptors (TLRs) on cell surface are essential to activate innate immune system and recognize microbial pathogens. Recent studies suggest that TLRs cannot only defend microbial immune responses, but also promote tissue regeneration after injury. This study investigated the possible mechanism of lipopolysaccharide (LPS) induced TLRs activation on the Hacat cell surface to promote wound healing.
METHODS: The experiment was performed at the Department of Burn and Skin Surgery, Xijing Hospital of Fourth Military Medical University of Chinese PLA in July 2007. ①Hacat cells were given by Department of Dermatology, Xijing Hospital of Fourth Military Medical University of Chinese PLA; LPS was the product of Sigma, and mouse anti-human TLR2 monoclonal antibody and rabbit antihuman TLR4 polyclonal antibody were purchased from Ebioscience Company. LPS (500 ng/L) and Hacat cells were co-cultured and divided into LPS 24, 48, and 72 hours groups. The cells cultured with dimethyl sulfoxide served as control. ②The influence of LPS on TLR2, TLR4 and nuclear factor-kappa B (NF-κB) expressions were detected by Western blot. The expressions of matrix metalloproteinase-3 (MMP-3), MMP-9 and vascular endothelial growth factor (VEGF) in Hacat cells cultured with LPS were detected by RT-PCR and real-time PCR.
RESULTS: Under light microscope, TLR2 and TLR4 expressions in normal epidermis and keratinocytes showed black blue. The expressions of TLR2, TLR4 and NF-κB in Hacat cells cultured with LPS for 24, 48, and 72 hours were significantly higher than control cells (P < 0.01). Moreover, the expressions of MMP-3 and VEGF in three LPS groups were significantly increased compared with control group (P < 0.01, P < 0.05). LPS 24 hours group showed similar MMP-9 secretion as the control group (P > 0.05), but in LPS 48 and 72 hours groups, the expression of MMP-9 was significantly higher (P < 0.05).
CONCLUSION: LPS can activate TLRs on the surface of Hacat cells to promote wound healing. The mechanism probably is LPS activate NF-κB signal conduction and secretion of MMP-3, MMP-9 and VEGF through TLRs.

Han YB, Hu DH, Yang CZ, Cai WX, Bai XZ, Hu XL. Mechanism of active Toll-like receptors on the surface of Hacat cells to promote wound healing.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(7):1272-1276(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-7/7k-1272(ps).pdf]

表皮角质形成细胞（keratinocytes，KCs）是皮肤创面愈合的主要修复细胞之一，创面愈合过程中表皮角质形成细胞增殖、迁移和分化，最终完成再上皮化过程。激活一些细胞的Toll样受体可以促细胞的增殖，如在老鼠中枢神经系统内的神经干细胞[1]，而且有研究发现角质细胞表面有TOLL样受体表达[2]。HacaT细胞为永生化角质形成细胞株，是一种转化但非致癌的细胞，由腹部表皮细胞衍化而成，它在生物特性上与正常人角质形成细胞相似。本实验通过检测激活表皮角质形成细胞表面TOLL样受体后对创面愈合的影响，对其促进创面愈合的机制作初步探讨。

设计：随机对照实验。
单位：解放军第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科。
材料：实验于2007-07在解放军第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科完成。角质细胞株Hacat（解放军第四军医大学西京医院皮肤科馈赠）；Dispase酶及DMEM培养基（Gibco公司）；脂多糖（Sigma公司）；引物由TaKaRa公司设计合成；小鼠抗人TOLL样受体2单克隆抗体、兔抗人TOLL样受体4多克隆抗体（ebioscience公司）；HRP-山羊抗鼠IgG（晶美公司）；碱性磷酸酶标记马抗小鼠抗体、碱性磷酸酶标记羊抗兔抗体（北京中山公司）；胰蛋白酶等为国产分析纯。微量分光光度计（美国Beckman DU800）。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预实施为第三作者，评估为第二作者。经正规培训，采用盲法评估。
方法：
Hacat细胞培养：Hacat用DMEM培养基加体积分数为0.1的胎牛血清在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中常规培养，细胞传代以2.5 g/L 胰酶和0.2 g/L EDTA 按V(胰酶)∶V(EDTA)=1∶1消化。将细胞随机分为脂多糖（500 ng/L）作用24 h 组、脂多糖作用48 h 组、脂多糖作用72 h 组，另设对照组，只加溶剂二甲基亚枫。
TOLL样受体2、TOLL样受体4免疫组织化学法染色：取Hacat传代细胞，用含体积分数为0.4甲醛的磷酸盐缓冲液室温固定12~20 min。磷酸盐缓冲液洗3 min×3次，加正常山羊血清封闭液15 min，加一抗（小鼠抗人TOLL样受体2、TOLL样受体4抗体1∶200）4 ℃ 孵育过夜，磷酸盐缓冲液洗涤后加入二抗（碱性磷酸酶标记马抗小鼠抗体 1∶750，碱性磷酸酶标记羊抗兔抗体1∶750），37 ℃ 孵育50 min 后加BCIP/NBT显色，核固红复染，在自动荧光显微镜图像采集系统下观察，并采集图像。
蛋白免疫印迹技术检测：取3.5×108 L-1 密度的细胞5 mL，磷酸盐缓冲液4 ℃ 洗涤后加入含8 mol/L 尿素、10% SDS、5 mol/L Tris、1 mol/L EDTA（pH7.5）的裂解液150 μL 裂解细胞，4 ℃ 离心去除沉淀，Bradford法测定蛋白浓度。取50 μg 蛋白质加入2×SDS凝胶加样缓冲液中，100 ℃ 加热10 min 使蛋白变性。各孔加样量为50 μg 10% SDS PAGE凝胶电泳、转膜、封闭、加一抗、辣根过氧化酶标记二抗，化学发光试剂增强反应，X射线片压片曝光，用凝胶成像系统分析。
反转录-聚合酶链反应：取106个细胞，以1 mL Trizol裂解细胞，氯仿、异丙醇进一步提取RNA，用微量分光光度计检测RNA样品纯度（A260/A280 > 1.7）。反转录及聚合酶链反应按试剂盒说明书进行。基质金属蛋白酶3上游引物：5’-CTG GGC CAG GGA TTA ATG GAG-3’，下游引物：5’-CAA TTT CAT GAG CAG CAA CGA GA-3’，产物102 bp；基质金属蛋白酶9上游引物：5’- CGC CCA TTT CGA CGA TGA C-3’，下游引物：5’- CGC CAT CTG CGT TTC CAA-3’，产物80 bp。血管内皮生长因子上游引物：5’-TGT CCT CAC ACC ATT GAA ACC ACT A-3’，下游引物：5’-AAT GGG CAC GTG GAT CCT G-3’，产物145 bp。为便于分析取脂多糖作用72 h 组与对照组基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、血管内皮生长因子进行反转录-聚合酶链反应分析。进一步分析使用Bio-RAD的IQ5系统进行Sybr Gree荧光定量聚合酶链反应分析。聚合酶链反应扩增条件为：95 ℃ 30 s，接着40个扩增循环：95 ℃ 15 s、64 ℃ 30 s，总体积20 μL 含cDNA 5 ng，10 μL Sybr Gree混合液，5 μmol/L 的引物，每个样品基因重复3管。结果按照IQ5分析软件采用比较CT法相对定量，以β-肌动蛋白为管家基因。
主要观察指标：①免疫组织化学观察TOLL样受体2、TOLL样受体4的表达。②蛋白免疫印迹检测脂多糖作用Hacat细胞24，48，72 h 后TOLL样受体2、TOLL样受体4及核因子κB的表达。③反转录-聚合酶链反应检测对照组与脂多糖作用 72 h 组基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子的表达。④荧光定量聚合酶链反应检测各组基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子基因的表达。
统计学方法：由第二作者采用SPSS 10.0统计软件包进行方差分析、t检验，实验数据以_x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

2.1 免疫组织化学观察TOLL样受体2、TOLL样受体4的表达光学显微镜下正常人皮肤表皮及角质细胞TOLL样受体2、TOLL样受体4表达呈蓝黑色，见图1~4。

2.2 蛋白免疫印迹检测脂多糖作用Hacat细胞24，48，72 h 后TOLL样受体2、TOLL样受体4及核因子κB的表达见图5。

脂多糖作用于Hacat细胞24，48，72 h 后TOLL样受体2、TOLL样受体4、核因子κB表达均高于对照组（P < 0.01）。
2.3 反转录-聚合酶链反应检测对照组与脂多糖作用72 h 组基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子的表达见表1。

与对照组相比，脂多糖作用72 h 组基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子表达增高（P < 0.05）。凝胶电泳结果见图6。

2.4 荧光定量聚合酶链反应检测各组基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子基因的表达见表2。

与对照组相比，其他3组基质金属蛋白酶3及血管内皮生长因子表达均增高（P < 0.01，P < 0.05）。脂多糖作用24 h 组基质金属蛋白酶9表达与对照组差异无显著性（P > 0.05），脂多糖作用48，72 h 组与对照组比较，差异显著（P < 0.05）。

本实验利用脂多糖激活角质细胞表面TOLL样受体从而激活核因子κB信号转导途径，探索其可能参与创面愈合的机制。TOLL样受体家族属于白细胞介素1受体/TOLL样受体超家族，主要分布于免疫细胞以及同外界相通的腔道上皮细胞表面，在巨噬细胞、树突状细胞等专职抗原提呈细胞表面的表达尤其丰富[3]，Pivarcsi等[4]研究发现，TOLL样受体2、TOLL样受体4在表皮及毛囊肿周围高表达。不同的TOLL样受体分子识别不同的病原体相关分子模式（Pathogen associated molecular pattern，PAMP），其配体几乎涵盖了人类所能遇到的所有病原体及其产物，从而赋予人类先天性抵抗感染的能力[3]。最近的研究表明，TOLL样受体不仅可以激活抵抗微生物的免疫系统，它还是组织损伤后启动创面修复敏感的检测系统。TOLL样受体在维持组织的自我更新、激活组织的再生等方面起着重要的作用[5]。许多证据证明TOLL样受体s在组织修复中发挥重要作用[6-9]。TOLL样受体2识别病原体及其产物的种类最多，如肽聚糖、脂多糖、脂蛋白、脂肽等，这些配基可引起相似的细胞内信号传导活动，因此TOLL样受体2被认为是具有中心作用的或中枢型模式识别受体。TOLL样受体4可激活p38磷酸化、p42/p44、MAPK信号转导通路及核因子κB信号转导途径激活相应的基因发挥抗炎及组织修复的作用[10]。所以激活TOLL样受体对促进创面愈合有重要意义。组织损伤后的再生是一个复杂的过程，如包含炎症反应、血管发生、细胞外基质的合成、再上皮化。损伤后坏死的细胞释放的细胞内产物激活树突状细胞分泌细胞因子，并促进树突状细胞的成熟，使其表达高水平的CD83、与溶酶体膜相关的糖蛋白、共刺激分子CD40和CD86[11]。如坏死细胞释放热休克蛋白可刺激巨噬细胞分泌细胞因子激活树突状细胞核因子κB信号转导途径激活抗原呈递反应及共刺激分子的表达[10]。组织创面愈合的过程中分泌基质金属蛋白酶，基质金属蛋白酶作用于细胞外基质中透明质酸产生的透明质酸分解产物可以激活TOLL样受体4信号转导通路，促进细胞产生细胞因子，促进创面愈合[12]。
基质金属蛋白酶为一特异的酶家族，其成员均为锌依赖性肽链内切酶，主要功能为降解细胞外基质[13]。对不同情况下的组织生理病理变化，如发育组织的形态形成、组织修复、血管生长、以及细胞脱离和迁移等都起着重要作用[14-18]。皮肤创面愈合过程中基质金属蛋白酶家族主要参与：①去除失活组织。②角朊细胞迁移。③血管再生。④结缔组织再塑形。⑤某些生长因子的活性调节[19]。基质金属蛋白酶3主要作用于层粘连蛋白、纤维连接蛋白、非螺旋胶原等，可能主要用于重建新的基底膜[20]。基质金属蛋白酶9作用于IV、V胶原，主要参与急性创面修复的几个早期步骤，包括角朊细胞从基底膜脱离、促进细胞沿创面基质爬行、纤维蛋白-纤维连接蛋白基质的再塑形等。血管内皮生长因子是潜在的最重要的刺激血管形成因子，它在血管形成、促进创面愈合与组织修复、促进组织再生方面起着重要的作用。血管内皮生长因子还是参与创面愈合中介导炎性反应和肉芽组织形成有关的重要生长因子。血管内皮生长因子是血管生成的主要调节因子，可以特异性的作用于血管内皮细胞，发挥促分裂、趋化等作用。外源性微生物激活角质细胞表面TOLL样受体后可以激活核因子κB信号转导通路，从而起到抵抗微生物及促进细胞分泌多种因子促进创面愈合的作用，故适当激活TOLL样受体对促进局部创面愈合有重要意义。

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