课题背景：在解放军海军总医院栾佐主任带领下，课题组在前期基础研究成果上结合神经干细胞移植治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤临床工作的实际需要而开展的，主要研究高压氧对缺氧缺血性新生大鼠外源性神经干细胞移植的影响，其内容包括高压氧对植入细胞存活、分化的影响，并从不同方面探讨其作用机制。从目前的研究成果看，高压氧可能有助于植入细胞的存活和分化。

创新要点：研究表明高压氧具有保护和促进内源性神经干细胞增殖的作用，还未见高压氧对移植后外源性神经干细胞作用的报道，本课题具有实用性和创新性。

偏倚或不足：①实验仅从移植后宿主脑组织神经元病理改变的角度来阐释高压氧对神经干细胞移植的影响，需进一步论证说明相关数据的统计学分析结果。②如能在此实验基础上增加模型组作对比，可更加体现单纯细胞移植及其联合高压氧治疗的效果差异。③实验只观察了短期疗效，如能设立多个不同观察时间点则更加完善。

1北京大学第一医院儿科，北京市 100034；2解放军海军总医院儿科，北京市 100037

白 洁☆，女，1978年生，北京市人，汉族， 2007年北京大学医学部毕业，博士，医师，主要从事新生儿疾病方面的研究。
bjzys2008@
163.com

通讯作者：栾 佐，硕士，主任医师，解放军海军总医院儿科，北京市 100037 luanzuo@yahoo.
com.cn

摘要
目的: 研究证明高压氧治疗能明显减轻缺氧后宿主脑区深部水肿，减少内源性神经元变性与坏死，并增加围产期鼠新生神经元数量与碱性成纤维生长因子活性。实验拟进一步观察缺氧缺血性脑损伤大鼠移植人神经干细胞后予高压氧治疗对脑组织神经元病理改变的影响。
方法：实验于2007-04在解放军海军总医院完成。①细胞来源及动物：经医院伦理委员会授权，孕妇知情同意下留取孕12周流产的人胎儿脑组织。新生7 d龄SD大鼠20只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：取胎儿脑组织，在无菌条件下培养扩增并制备成人神经干细胞单细胞悬液。20只大鼠均建立缺氧缺血性脑损伤模型，3只死亡，剩余鼠随机数字表法分为2组，细胞移植+高压氧组9只，单纯细胞移植组8只。造模后3 d，两组大鼠均于左侧侧脑室进行细胞移植，注射位点以前囟为参照点，AP= -1 mm，ML= -1.5 mm，DV= -4.0 mm，缓慢注入2×106 L-1细胞悬液5 μL。移植后1 h，将细胞移植+高压氧组大鼠放入高压氧舱内，给予高压氧通气，升压及降压过程各15 min，最终达压力为1.8个绝对大气压，稳压60 min，1次/d，连续10 d。两组大鼠麻醉后断头取脑，制备组织切片。③实验评估：免疫荧光法检测神经干细胞巢蛋白的表达、人神经干细胞植入后神经丝蛋白表达及其向神经元分化情况。尼氏染色检测移植后脑组织皮质、海马神经元形态、结构的变化。
结果：移植过程中细胞移植+高压氧组有1只鼠因麻醉死亡，高压氧通气过程中没有动物死亡。①人神经干细胞的鉴定：人胎儿脑组织体外培养12 d获取生长旺盛的人神经干细胞小集落，即神经球。倒置显微镜下观察可见每个小集落为数十个细胞构成，细胞折光性强，周边有清晰的光晕。免疫荧光标记大部分活细胞表达巢蛋白。②人神经干细胞植入后神经丝蛋白表达及其向神经元分化：植入后10 d，两组在皮质及海马区均可见神经丝蛋白阳性细胞，即植入细胞分化形成的神经元，其细胞形态与宿主内源性细胞相似。③神经元尼氏染色：两组大鼠均没有发现肿瘤形成。移植后10 d与单纯细胞移植组相比，细胞移植+高压氧组海马及皮质区组织细胞水肿程度明显减轻，且海马CA1区、CA3区、齿状回神经元排列更整齐，组织结构更完整。
结论：缺氧缺血性脑损伤新生大鼠移植人神经干细胞后，高压氧治疗可减轻损伤易感区组织细胞水肿程度，并使海马区神经元结构更加完整，推测有可能促进细胞的成活、迁移及分化。
关键词：神经干细胞移植；高压氧；缺氧缺血性脑损伤；尼氏染色

白洁，栾佐，汪兆艳.高压氧对外源性人神经干细胞移植治疗损伤脑组织神经元病理状态的改善效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(8):1401-1405 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1401(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)08-01401-05

收稿日期：2007-09-13
修回日期：2007-12-07
(07-50-9-5026/ZS·Y)

Effect of hyperbaric oxygenation on neuronal pathological improvement after exogenous human neural stem cell transplantation for treating brain damage

Abstract

AIM:Research has proved that hyperbaric oxygenation (HBO) therapy is good for relieving brain edema after hypoxia attack, and helpful of reducing endogenetic neurons degeneration and death, increasing the amount of regenerated neurons and basic fibroblast growth factor activity of perinatal rats. Therefore, this study investigated the effect of HBO on neuronal pathological changes after human neural stem cells (hNSCs) transplantation for neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage (HIBD).
METHODS: This experiment was carried out in April 2007 at Naval General Hospital of Chinese PLA.①Cell resource and animals: Authorized by the Ethics Committee of the hospital, and with the informed consent of gravida, we obtained the fetal brain tissue from 12-week abortus. Twenty 7-day-old SD rats were bought from Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technological Company. Any manipulation of the animal was consistent with the standard of Ethics.②Methods: Human fetal brain tissues were obtained to make NSCs single cell suspension under sterile condition. Twenty neonatal rats were used for HIBD model, 3 died during procedure. Rest of them divided randomly into two groups: transplantation+HBO group (n=9) and transplantation group (n=8). The rats received hNSCs implantation on 3 days after modeling. Coordinates as follows: AP= -1 mm, ML=-1.5 mm, DV=-4.0 mm, 5 μL hNSCs suspension (2×106 L-1 concentration) was implanted into the left cerebral ventricle gradually. The rats in transplantation+HBO group were administered HBO treatment (1.8 atmosphaera absolutus, 15 minutes procedure for boosting pressure and underpressure, 1 hour daily for 10 days) 1 hour after hNSCs transplantation. Brains were removed following decapitation to prepare sections for further use.③Evaluation: Immunofluorescence analysis for detecting the survival and neurons differentiation of the transplanted hNSCs by Nestin and neurofilament (NF) expression as well as Nissl staining for neuronal pathological changes in cortex and hippocampus.
RESULTS: One rat of implantation+HBO group died during the implantation procedure, and no death was found during HBO therapy.①Identification of hNSCs: After cell culture in vitro for 12 days, the eugonic neurospheres with high refraction and clear halation peripherally were gained under inverted microscopy. Most of them expressed Nestin by immunofluorescence.②NF expression and neurons differentiation after implantation: Ten days after implantation, NF-positive cells, that was the differentiated neurons could be detected in cortex and hippocampus of both groups, with similar form of endogenetic cells.③Nissl staining of neurons: Tumor was observed in neither group. Ten days after implantation, cell and tissue edema was much relieved in hippocampus and cortex area, and neurons were well-arranged and intact in CA1, CA3 and gyrus dentatus in hippocampus of transplantation+HBO group compared with those in transplantation group.
CONCLUSION: HBO therapy can relieve edema in hippocampus and cortex, and improve neurons arrangement in hippocampus after hNSCs transplantation for neonatal rats with HIBD. Therefore, HBO therapy is probably helpful for survival, migration and neurons differentiation after hNSCs implantation.

Bai J, Luan Z, Wang ZY.Effect of hyperbaric oxygenation on neuronal pathological improvement after exogenous human neural stem cell transplantation for treating brain damage.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(8):1401-1405(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1401(ps).pdf]

0 引言

研究证实神经干细胞移植治疗新生动物缺氧缺血性脑损伤具有一定疗效[1-2]，然而这项技术目前还处于起步阶段，仍有许多问题尚待解决，核心问题是如何提高移植效果。
既往研究探索并证实移植技术的提高以及联合应用药物有助于保护植入细胞，减少其死亡[3-6]。那么，是否也有方法在保护植入细胞的同时亦能够保护宿主内源性细胞，改善移植内环境，从而进一步提高移植效果呢？研究证明高压氧治疗能明显减轻缺氧后宿主脑区深部水肿，减少内源性神经元变性与坏死，并增加围产期鼠新生神经元数量与碱性成纤维生长因子的活性等[7-11]，但至今尚未见高压氧治疗对外源性人神经干细胞移植后脑组织细胞病理改变的报道。本实验通过高压氧辅助人神经干细胞移植治疗，以尼氏染色观察比较高压氧治疗对移植后脑组织神经元病理改变的影响及其意义。

1 材料和方法

设计：细胞观察实验。
单位：北京大学第一医院儿科，解放军海军总医院儿科。
材料：实验于2007-04在解放军海军总医院完成。①经医院伦理委员会授权，孕妇知情同意下留取孕12周流产的人胎儿脑组织。②新生7 d龄SD大鼠20只（购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物质量合格证号：SCXK（京）2007-0001），体质量14~17 g，雌雄不拘，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。③甲苯胺蓝（Amresco 0672）；多克隆兔抗-人巢蛋白，山羊抗兔IgG-FITC，单克隆小鼠抗-人神经丝蛋白，山羊抗小鼠IgG-TRITC（北京中杉金桥生物技术有限公司）；江湾Ⅰ型C立体定向仪（解放军第二军医大学）；5 μL微量进样器（上海医用激光仪器厂）；DWC150-300型透明纯氧动物实验舱（上海七零一所杨园医用氧舱制造厂）；BH-2显微镜，倒置显微镜CKX41-32（Olympus）；Retiga-SRV数码成像CCD（Q-imaging）。
设计、实施、评估者：设计为第一、二作者，实施为第一、三作者，结果评估为全部作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
人神经干细胞的制备与鉴定：取人胎儿脑组织，在无菌条件下培养扩增并制备成人神经干细胞单细胞悬液，同时取样，通过免疫荧光法检测巢蛋白的表达，以鉴定所培养细胞的神经干细胞特性，一抗为多克隆兔抗-人巢蛋白（稀释比例1∶80），二抗为山羊抗兔IgG-FITC（稀释比例1∶100）。
缺氧缺血性脑损伤模型的制作：20只大鼠均造模，先以6%水合氯醛30 mg/kg腹腔麻醉，分离并结扎左颈总动脉，恢复2~4 h后，放入含8%氧气、92%氮气的容器中通气2.5 h，用水浴箱控制周围温度在34~35 ℃，待鼠苏醒后送回孕母处。模型制作过程共死亡3只，剩余17只鼠随机数字表法分为2组，细胞移植+高压氧组9只，单纯细胞移植组8只。
人神经干细胞的移植：造模后3 d，两组大鼠麻醉后固定在立体定向仪上，将人神经干细胞注入左侧（损伤侧）侧脑室，注射位点以前囟为参照点，从针达硬脑膜开始计算：AP（前囟后）= -1 mm，ML（中线左侧）= -1.5 mm，DV（皮质向下垂直深度）= -4.0 mm。通过微量注射器匀速缓慢注入2×106 L-1细胞悬液5 μL，留针5 min，缓慢退针。移植前后两组大鼠均未予免疫抑制剂。移植过程中细胞移植+高压氧组有1只鼠因麻醉死亡。
高压氧治疗：移植后1 h，将细胞移植+高压氧组大鼠放入高压氧舱内，给予高压氧通气，升压及降压过程各15 min，最终达压力为1.8个绝对大气压（ATA），稳压60 min，1次/d，连续10 d。高压氧通气过程中没有动物死亡。
组织切片的制备：高压氧通气10 d后（即移植后10 d），将两组动物麻醉，先后以常温生理盐水、预冷的40 g/L多聚甲醛经心脏灌注后取脑。将脑块先后放入40 g/L多聚甲醛灌注液中浸泡24 h、30%蔗糖液中72 h然后取出，液氮冰冻后放入-80 ℃冰箱中保存待用。随后将脑块制成冰冻切片，冠状切片，片厚25 μm，每隔4张留取2张。分别用于免疫荧光染色和尼氏染色。
人神经干细胞植入后神经丝蛋白表达及其向神经元分化免疫荧光检测：切片取出后于室温下放置 30 min，4 ℃冰丙酮固定30 min，磷酸盐缓冲液冲洗 10 min×3次，5%山羊血清封闭30 min，加入单克隆小鼠抗-人神经丝蛋白（一抗，与大鼠无交叉反应，稀释比例1∶200）后放入4 ℃冰箱过夜，磷酸盐缓冲液冲洗5 min×3次，加入相应的山羊抗小鼠IgG-TRITC（二抗，稀释比例1∶100），室温下暗室中反应2.5 h，磷酸盐缓冲液冲洗5 min×3次，90%甘油封固。阴性对照实验以抗体稀释液代替一抗。
神经元尼氏染色：将切片于室温下放置30 min，蒸馏水冲洗后放入预热至50 ℃的1%甲苯胺蓝水溶液中，并在56 ℃温箱中染20 min，蒸馏水冲洗后放入体积分数为0.7的乙醇中约1 min，再用体积分数为0.95的乙醇分化，镜下控制，以尼氏小体显示清晰为度，无水乙醇迅速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。在明场下观察神经细胞核呈淡蓝色，尼氏小体呈深蓝色。
主要观察指标：①人神经干细胞的鉴定。②人神经干细胞植入后神经丝蛋白表达及其向神经元分化情况。③神经元尼氏染色。

2 结果

2.1 人神经干细胞的鉴定 人胎儿脑组织体外培养 12 d获取生长旺盛的人神经干细胞小集落，即神经球。倒置显微镜下观察可见每个小集落为数十个细胞构成，细胞折光性强，周边有清晰的光晕（图1）。神经球行免疫荧光标记后，可见大部分活细胞表达巢蛋白，以FITC标记胞质呈绿色（图2）。

2.2 人神经干细胞植入后神经丝蛋白表达及其向神经元分化情况 人神经干细胞植入脑室后10 d，免疫荧光检测可见成熟神经元标记物神经丝蛋白，以TRITC标记胞浆呈红色。在皮质（图3）及海马（图4）区两组均可见神经丝蛋白阳性细胞，即植入细胞分化形成的神经元，其细胞形态与宿主内源性细胞相似，如在皮质分化形成的锥体细胞。

2.3 神经元尼氏染色结果 两组大鼠均没有发现肿瘤形成。移植后10 d尼氏染色结果显示，单纯细胞移植组的组织、细胞空泡现象相对明显；细胞移植+高压氧组海马及皮质区组织细胞水肿程度明显减轻，且海马CA1区、CA3区、齿状回神经元排列更整齐，组织结构更完整（图5）。

 
3 讨论

尽管对高压氧治疗新生动物缺氧缺血性脑损伤的疗效判定还存在争议，但较多相关研究都证实高压氧有助于改善新生动物缺氧缺血性脑损伤模型的病理改变及其功能恢复，减轻神经元损伤的进展，减少内源性细胞凋亡和脑萎缩，提供神经保护作用[10,12-14]；此外，高压氧还可以使缺氧缺血性脑损伤大鼠死亡率降低，脑组织病变减轻，左/右脑重量比值增加[13]。本实验采用高压氧治疗辅助人神经干细胞移植，旨在发挥高压氧可能的神经保护作用，以期提高神经干细胞移植效果。
本实验首先对体外培养的人胎脑来源的人神经干细胞进行鉴定，结果可见大部分活细胞表达神经干细胞标志巢蛋白，细胞移植及高压氧治疗10 d后，植入细胞不但广泛迁移至各个脑区，尤其是皮质、海马等损伤区，而且分化形成神经元，其迁移与分化的行为方式与内源性神经干细胞相似[15]，其形态与宿主细胞形态类似，证实本实验人神经干细胞移植是成功的。
进一步观察对比单纯细胞移植和细胞移植+高压氧治疗10 d后脑组织病理变化及疗效，尼氏染色结果提示，细胞移植+高压氧组治疗后脑海马及皮质区的脑组织、神经元水肿较单纯细胞移植组减轻，海马区神经元结构更加完整。结合高压氧可以上调缺血后脑组织神经营养因子（NT-3）及碱性成纤维生长因子的表达[11,16]，减少缺氧缺血后生发区内源性神经干细胞的死亡[17]，推测高压氧在改善移植后宿主脑组织微环境的同时，可促进内、外源性神经干细胞的增殖和分化[18]；此外，在保护内源性神经干细胞的同时，可以为植入细胞向神经元的分化提供了更为有利的移植内环境，可更好地发挥移植细胞与宿主间的相互作用，保护植入人神经干细胞，进而改善移植效果。当然，高压氧提高外源性神经干细胞移植效果的具体保护机制，如是否减少植入细胞的凋亡、增加损伤易感区神经元的分化等，还需实验进一步论证。
神经干细胞移植后是否会发生免疫排斥反应目前尚有争议，现有研究表明将人来源的神经干细胞植入新生鼠脑中，移植后1年未应用免疫抑制剂环孢素，并未监测到免疫排斥反应情况的发生，其原因可能与神经干细胞较少表达MHCⅡ免疫原性分子有关[19-20]。本实验在移植前后均未给予免疫抑制剂治疗，观察10 d未见急性排斥反应，但仍不排除因慢性排斥反应导致晚期细胞存活率的下降[21]，因此有必要进一步远期观察。

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