通心络对大鼠胚胎神经干细胞源性神经细胞谱系的影响*★

蒋海山，李求实，陆兵勋，王立新

课题背景：国家自然科学基金资助项目。课题致力于研究通心络治疗缺血再灌注脑损伤的机制以及神经干细胞在其中的作用。目前已在动物模型实验中观察到大鼠脑缺血再灌注损伤后，其缺血侧海马齿状回、室下区神经元和星形胶质细胞出现反应和增殖，而通心络可显著增加大脑中动脉阻塞鼠脑的神经干细胞增殖、分化能力，说明通心络可能具有影响神经干细胞增殖及向各种神经细胞分化的作用。

应用要点：实验采用相对成熟的神经干细胞培养的方法，将其应用于通心络含药血清中，序贯的观察了不同剂量通心络含药血清对培养神经干细胞的作用以及相关时效、量效的关系。证实了通心络有利于促进大鼠胚胎神经干细胞增殖及向神经元分化，并存在时效、量效关系。

偏倚或不足：通过血清药理途径研究中药的作用虽然尽可能的模拟了体内中药实际作用方式及环境，但就含药血清而言，其组分仍然不明，无法确切得知其对组织、细胞产生作用的具体成分，今后需在这一方面进行改进。

蒋海山★，男，1978年生，江苏省南京市人，汉族，2003年解放军第一军医大学毕业，硕士，主治医师，主要从事神经病学临床及基础研究。
jhsh1978@yahoo.com.cn

摘要
目的:前期体内动物模型实验说明，通心络可能具有影响神经干细胞增殖及向各种神经细胞分化的作用。实验拟观察通心络对大鼠胚胎神经干细胞源性神经细胞谱系的影响以及时效、量效的关系。
方法：实验于2007-06/10在南方医科大学机能学实验室完成。①实验材料：孕12~14 d SD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。通心络，主要成分为人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等，由石家庄以岭药业股份有限公司生产，国药准字Z19980015。通心络含药血清的制备：按大剂量组1 g/（d·kg）、小剂量组0.5 g/（d·kg）分别予大鼠通心络混悬液灌胃，7 d后抽血离心，吸取血清，过滤消毒，分装，-70 ℃冻存备用。②实验方法：自孕12~14 d大鼠胚胎中分离培养神经干细胞，取第3代细胞分别给予大、小剂量组通心络含药血清干预。以添加普通血清干预的为对照。③实验评估：于培养1，3，7 d通过免疫荧光染色观察各种类型神经细胞所占比例。
结果：①神经干细胞经通心络含药血清干预后1 d，仅在大剂量组海马齿状回有极少数细胞呈BrdU(+)GFAP(+)，其余细胞都呈BrdU(+)Nestin(+)，小剂量组和对照组均为BrdU(+)Nestin(+)细胞。②经通心络含药血清干预后3d，大剂量组、小剂量组和对照组Nestin(+)、βtubulin(+)、GFAP(+)细胞比例差异有显著性意义（P < 0.01），GalC(+)细胞比例差异无统计学意义（P > 0.05）。③大鼠胚胎神经干细胞经通心络含药血清干预后：各组Nestin(+)细胞比例先降后升；βtubulin(+)细胞比例大剂量组持续上升，小剂量组和对照组先升后降；GFAP(+)细胞比例大剂量组先升后降，小剂量组和对照组持续上升，GalC(+)细胞比例大、小剂量组均较平稳，对照组7 d时明显上升。
结论：通心络有促进大鼠胚胎神经干细胞增殖及向神经元分化的效应，并存在时效、量效关系，剂量越大效应越明显及持久。
关键词：神经干细胞；通心络；细胞分化/药物作用

蒋海山，李求实，陆兵勋，王立新.通心络对大鼠胚胎神经干细胞源性神经细胞谱系的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(8):1406-1409 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1406(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)08-01406-04

Effect of Tongxinluo on neurocyte lineage derived from rat embryonic neural stem cells

AIM: Tongxinluo had showed effects of inducing proliferation and differentiation on neural stem cells in previous observations on animal models. The experiment would investigate the time-effect and dose-effect relationship of Tongxinluo on neurocyte lineage development from rat embryonic neural stem cells (NSCs).
METHODS: Experiments were performed at the Laboratory of Functional Science of Southern Medical University from June to October 2007. ①Pregnant rats of 12-14 days were provided by Experimental Animal Center of Southern Medical University. The experiment was performed in strict compliance with all standards for ethics. Tongxinluo contained ginseng, leech, scorpion, ground beetle, centipede, pellicula cicadae, red peony root, borneol and so on. Tongxinluo was produced by Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Ltd., No. Z19980015. Preparation of serum containing Tongxinluo: 1 g/kg per day Tongxinluo suspension was given by lavage in rats of high-dose Tongxinluo group, and 0.5 g/kg per day in rats of low-dose Tongxinluo group. 7 days later, sera were extracted from all the rats and sterilized with filtrating, followed by separate-loading and cryopreservation at –70 ℃. ②NSCs cultured were separated from 12th-14th day SD rat embryo. The third passage of cells was treated with serum containing Tongxinluo in the high-dose and low-dose Tongxinluo group. Rats were treated with common serum as a control. ③Proportion of various kinds of nerve cells was observed by immunofluorescence staining at days 1, 3 and 7.
RESULTS: ①At day 1, there was few cells labeled with 5-bromodeoxyuridine (BrdU) (+) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) (+) in high-dose Tongxinluo group, with rest cells all labeled with BrdU (+) and Nestin (+). While in low-dose Tongxinluo group and control group, all cells were BrdU(+)Nestin(+). ②At day 3, the ratios of cells labeled with Nestin (+), βtubulin (+) or GFAP (+) differentiated with each other (P < 0.01). The ratios of GalC (+) cells had no difference between each other group (P > 0.05). ③The ratios of NSCs labeled with nestin (+) decreased soon after administered Tongxinluo, and increased after that. The ratios of βtubulin (+) cells increased in the high-dose Tongxinluo group while increased firstly then decreased in the low-dose Tongxinluo group and control group. The ratios of GFAP (+) cells increased in the low-dose Tongxinluo group and control group while increased firstly then decreased in the high-dose Tongxinluo group. The ratios of GalC (+) cells had no remarkable change in the high-dose and low-dose Tongxinluo group, but increased significantly at day 7 in the control group.
CONCLUSION: Tongxinluo may induce proliferation and neuronal differentiation of rat embryonic NSCs with time-effect and dose-effect relationship. The more Tongxinluo is administered, the more significant and permanent effects will be achieved.

Jiang HS, Li QS, Lu BX, Wang LX.Effect of Tongxinluo on neurocyte lineage derived from rat embryonic neural stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(8):1406-1409(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1406(ps).pdf]

在动物模型体内实验研究中[1-2]，作者观察到大鼠缺血再灌注损伤后，其缺血侧海马齿状回（Hippocampal dentate gyrus，HDG）、室下区（Subventricular zone，SVZ）神经元和星形胶质细胞出现反应和增殖，而通心络可显著增加大脑中动脉阻塞鼠脑的神经干细胞增殖、分化能力。说明通心络可能具有影响神经干细胞增殖及向各种神经细胞分化的作用。为了探讨通心络对大鼠胚胎神经干细胞源性神经细胞谱系的影响，本实验进行了相关体外干预实验。

设计：随机对照细胞实验。
单位：南方医科大学附属南方医院神经内科。
材料：实验于2007-06/10在南方医科大学机能学实验室完成。孕12~14 d SD大鼠，由南方医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。通心络（主要成分为人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等）：石家庄以岭药业股份有限公司生产，国药准字Z19980015。通心络含药血清：按大剂量组1 g/（d·kg）、小剂量组0.5 g/（d·kg）分别予大鼠通心络混悬液灌胃，对照组给予等量生理盐水, 7 d后抽血离心，吸取血清，过滤消毒，分装，-70 ℃冻存备用。DMEM/F12（1∶1）、B27 supplement、Penicillin-Streptomycin liquid（100×）购自Gibco公司；Glucose、BrdU购自Sigma公司；L-Glutamine购自Amresc公司；EGF、bFGF购自Peprotech公司；台盼蓝试剂盒购自杰美公司；Heparin国产；Anti-BrdU、Anti-Nestin、Anti-βtubulin、Anti-GalC、DAPI、Donkey anti-Goat IgG TRITC、Donkey anti-Mouse IgG FITC、Normal donkey sera购自Santa公司；Anti-GFAP购自Zymed公司；Donkey anti-Rabbit IgG TRITC购自TBD公司。TritonX-100购自Amresco公司。0.22 μm针式过滤器购自Millipore公司；25 cm2细胞培养瓶、 24孔培养板购自Corning公司。神经干细胞培养液：含1×B27、0.06％Glucose、2 mmol/L Glutamine、 2 mg/L Heparin、1×Penicillin-Streptomycin liquid的DMEM/F12(1∶1)，添加EGF 20μg/L、bFGF 20μg/L。PBS（0.01mol/L）：1 000 mLPBS含KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，NaCl 8.0 g，Na2HPO4 ·2H2O 1.56 g。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、四作者，全体作者参与实施与评估，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
胚胎神经干细胞分离、培养、传代和鉴定：按常规方法进行。200 μL细胞悬液，用甩片法将细胞固定在载玻片上；4％多聚甲醛室温固定40 min后晾干；经封闭、透膜等处理后一抗4 ℃24 h，二抗室温避光孵育60 min；DAPI染核2 min；荧光镜检。
实验分组：根据预实验结果拟观察7 d，分为1 d、3 d、7 d组，每组再分3小组，分别为大剂量通心络血清组、小剂量通心络血清组、对照血清组。取10 μL第2~7代细胞悬液接种于预置无菌盖玻片的24孔培养板中，按照分组予以标记，添加培养液400 μL。培养液组成：神经干细胞培养液+10％相应血清。培养 1 d、3 d、7 d后予免疫荧光染色检测，检测前24 h在培养液中加入BrdU，终浓度为5 μmol/L，孵育24 h。
免疫荧光染色及结果判定：将BrdU与Nestin、 βtubulin、GFAP、GalC之一进行免疫荧光双标，以观察干预后不同时间各种类型神经细胞所占比例。
主要观察指标：各组含药血清干预后1，3，7 d时Nestin、βtubulin、GFAP或GalC阳性细胞数与DAPI阳性细胞数。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0进行统计处理，行R×C表资料的x2检验。

2.1 大鼠胚胎神经干细胞培养及鉴定原代培养初期细胞大部分呈小球形，透亮，呈悬浮状态生长，可见少量其他细胞（如红细胞）及无光泽的死细胞。随着继续培养，球形细胞通过聚集、分裂等方式逐步形成细胞团—神经球。同时其他细胞及孤立球形细胞开始出现坏死、崩解，细胞碎屑、死细胞沉底。培养12 h时已有大小不等的细胞团形成，仍有少量散在细胞，存活的细胞形态更加均一，呈透亮的球形。随着培养时间的延长，仅剩大小不一的细胞团，几乎没有游离的活细胞存在，细胞团周边部分细胞贴壁。原代及第1代细胞形成细胞团速度快，易形成巨型细胞团，背景杂质细胞多。自第2代开始，细胞形态及性质趋同，生长状态好，形成细胞团大小也较均一，背景渐干净。自第8代开始，细胞形态及性质仍较一致，但细胞生长状态开始变差，背景又开始出现杂质，细胞与细胞之间的连接变松散。免疫荧光染色所有细胞均呈Nestin(+)，见图1。

2.2 通心络含药血清干预对大鼠胚胎神经干细胞源性神经细胞谱系的影响神经干细胞经通心络含药血清干预后1d，仅在大剂量通心络含药血清组有极少数细胞呈BrdU(+)GFAP(+)，几乎所有细胞均呈BrdU(+)Nestin(+)，小剂量通心络含药血清组和对照组均为BrdU(+)Nestin(+)细胞。经通心络含药血清处理后3 d及7 d，以DAPI(+)细胞数为总细胞数，各组Nestin(+)、βtubulin(+)、GFAP(+)、GalC(+)细胞与DAPI(+)细胞比值为阳性细胞比例，见表1，2。干预后3 d，大剂量通心络含药血清组、小剂量通心络含药血清组和对照组之间 Nestin(+)、βtubulin(+)、GFAP(+)细胞比例差异有显著性意义（P < 0.01），GalC(+)细胞比例差异无统计学意义（P > 0.05）；干预后7 d，大剂量通心络含药血清组、小剂量通心络含药血清组和对照组之间Nestin(+)、βtubulin(+)、GFAP(+)、GalC(+)细胞比例差异有显著性意义（P < 0.01）。

神经干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能特性的神经系统原始细胞[3]。自1992年Reynolds首次报道后，已逐渐成为治愈神经系统损伤最有希望的途径之一[4-5]。使用神经干细胞治疗的优势在于低免疫源性，且易于与宿主组织建立联系，尽可能的修复神经网络[6-7]。应用神经干细胞治疗神经系统损伤策略主要分为激活内源性神经干细胞和移植外源性神经干细胞两大类[8]。有实验证实当发生神经元凋亡时，可在原位诱导内源性神经干细胞分化为脑区特异性的神经元，并可以重新与周围神经元建立突触联系[9]。在成年哺乳动物脑中，内源性神经干细胞主要存在于两个部位，海马齿状回的SGZ，为海马提供新生神经元，以及沿着侧脑室的SVZ，为嗅球提供新生神经元[10]。通过前期动物实验作者发现大鼠缺血再灌注损伤后，其缺血侧HDG、SVZ神经元和星形胶质细胞出现反应和增殖，而通心络可显著增加这一侧鼠脑的神经干细胞增殖、分化能力，效应以通心络大剂量组更为显著(P < 0.01)[1-2]。说明通心络可能具有激活内源性神经干细胞修复神经系统损伤的作用。
在进一步的体外实验研究中，作者发现：①3 d时大、小剂量通心络含药血清组与对照组在Nestin(+)、 βtubulin(+)、GFAP(+)细胞比例方面存在显著性差异； 7 d时大、小剂量通心络含药血清组与对照组在Nestin(+)、GFAP(+)、GalC(+)细胞比例方面存在显著性差异，而大剂量通心络含药血清组与另2组在βtubulin(+)细胞比例方面也存在显著性差异。实验结果提示通心络含药血清早期即可促进神经干细胞分化，且似乎有建立适合神经干细胞向神经元分化的微环境的作用，其具体表现在首先神经干细胞分化出少量星型胶质细胞，但随后后者停滞在一个较低水平而前者又分化出大量的神经元，相对来说对照组胶质细胞比例偏高，胶质细胞虽然具有神经营养作用但也是已知的大脑损伤后形成胶质瘢痕的基础。②3 d时大、小剂量通心络含药血清组在促进神经干细胞增殖分化效应方面无显著性差异，7 d时大剂量通心络含药血清组βtubulin(+)细胞明显高于小剂量通心络含药血清组，说明大剂量的通心络更有利于促进神经干细胞的神经元向分化且有利于新生神经元的存活，通心络剂量增大还有助于延长这种效应的时间，这与体内实验研究结果一致。③体内实验研究中，Nestin(+)细胞的比例随实验时间延长先增多后下降，而在体外实验研究中，大、小剂量通心络含药血清组两组Nestin(+)细胞在3 d时明显下降，在7 d时又有小幅回升，造成差异的原因可能与实验环境不同有关，体内实验研究细胞处于组织中，实验环境更均衡，并有持续发展的潜力，而体外研究中神经干细胞分化后不再表达Nestin(+)，造成阳性细胞锐减，但因含药血清具有维持神经干细胞分裂增殖的能力，所以随着时间的延长，Nestin(+)细胞数量会有小幅回升，而对照组因不具备这种能力，7 d时Nestin(+)细胞数量仍在进一步下降。④实验中观察到对照组7 d时GalC(+)少突胶质细胞比例异常增高，具体机制及作用尚不明了，需进一步实验研究。⑤由于1 d时各组细胞均为BrdU(+)Nestin(+)，干预后出现 βtubulin(+)、GFAP(+)、GalC(+)细胞，说明干预前培养的是神经干细胞，且其具有增殖、分化能力。
如何促进神经干细胞向所需的神经细胞分化，建立合适的细胞谱系修复因神经系统损伤造成的功能障碍是目前国外、国内研究的热点问题，其中涉及到许多不同的细胞因子、信号转导通路等，由多种介质介导，但最终调控神经干细胞聚集、分化为所需神经细胞的基础是基因[11-19]。关于中药对神经干细胞增殖、分化的影响国内许多学者也进行了大量的研究[20-21]。借鉴国内外研究的经验及在前期体内实验研究的基础上作者研究了通心络含药血清对大鼠胚胎神经干细胞源性神经细胞谱系的影响及其时效、量效关系。实验结果提示通心络有利于促进大鼠胚胎神经干细胞增殖及向神经元分化，存在时效、量效关系，其分子机制还有待进一步研究。

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