课题背景：广西自然科学基金项目（0640153）。目前课题研究成果已能够成功而熟练地分离、提取骨髓基质干细胞，并且成功地进行原代细胞与传代细胞培养，初步证实三七总皂苷能抑制酒精诱导兔骨髓基质干细胞的成脂分化,并可以促进其成骨分化。

应用要点：通过检测含酒精培养液培养的骨髓基质干细胞内三酰甘油含量与碱性磷酸酶活性的变化，观察三七总皂苷对骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化的抑制作用及向成骨细胞分化的诱导作用。结果表明，在酒精作用后的骨髓基质干细胞继续培养过程中,加入50，100 mg/L两种浓度三七总皂苷可促进骨髓基质干细胞的成骨表达,而抑制成脂表达。

相关链接：研究证明,酒精能够促使骨内脂肪堆积, 抑制成骨分化,导致成骨不足, 骨小梁稀疏、变细, 骨密度降低, 最终可发生骨质疏松或骨坏死。三七总皂苷是三七的主要活性成分。已有研究证实，三七总皂苷能阻断受体操纵性钙通道、增强一氧化氮的扩张血管作用、改善微循环、具有抗缺血再灌注损伤的作用。而三七总皂苷对酒精性骨坏死的防治作用研究尚少。

广西中医学院附属瑞康医院，1骨科，2检验科，广西壮族自治区南宁市 530011

王大伟，男，1956年生,广西壮族自治区南宁市人, 汉族，1983年广西中医学院毕业，主任医师，硕士生导师, 主要从事髋膝关节相关疾病方面的研究。
wdw1956@
yeah.net

通讯作者：潘 华，在读硕士，广西中医学院附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011
panhua05@
sina.com

广西自然科学基金项目（064015
3）*（项目负责人：王大伟）

摘要
目的:三七总皂苷能阻断受体操纵性钙通道，增强一氧化氮的扩张血管作用，改善微循环，具有抗缺血再灌注损伤的作用，关于三七总皂苷对酒精性骨坏死防治作用的研究尚少。实验拟观察三七总皂苷对酒精诱导兔骨髓基质干细胞成脂分化的抑制作用。
方法：实验于2006-11/2007-08在广西医科大学完成。①实验材料：三七总皂苷由江苏康宝制药有限公司提供（国药准字Z32020670）。4周龄大白兔由广西医科大学实验动物中心提供，清洁级，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：采用密度梯度离心法与贴壁法相结合体外分离、培养兔骨髓基质干细胞。取第3代细胞,并随机分为3组：空白组：细胞在含10%胎牛血清DMEM培养基中培养,不加酒精和三七总皂苷；模型组:每次更换培养液时加酒精0.09 mol/L；50 mg/L三七总皂苷组:每次更换培养液时, 加0.09 mol/L酒精与三七总皂苷50 mg/L；100 mg/L三七总皂苷组:每次更换培养液时, 加酒精0.09 mol/L与三七总皂苷100 mg/L。③实验评估：检测细胞内三酰甘油含量与碱性磷酸酶活性。
结果：①干预14 d时,模型组细胞内碱性磷酸酶活性降低,明显低于三七总皂苷干预组和空白组（P < 0.05）。三七总皂苷干预两组细胞内碱性磷酸酶活性,与空白组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。②干预21 d时,模型组脂滴最多,三七总皂苷干预两组较模型组明显减少(P < 0.05),空白组未见明显脂滴出现。③三七总皂苷干预组和空白组三酰甘油含量差异无统计学意义 (P > 0.05) ,三七总皂苷干预组和空白组细胞内三酰甘油含量低于模型组细胞内三酰甘油含量(P < 0.05)。
结论：三七总皂苷能抑制酒精诱导的兔骨髓基质干细胞成脂分化,而促进成骨分化,可能有治疗酒精性骨股头缺血性坏死的作用。
关键词：三七总皂苷;抑制;酒精;骨股头缺血性坏死;成脂分化;成骨分化

王大伟，潘华，李红波，王换新，陈跃平，顾国龙.三七总皂苷对酒精诱导骨髓基质干细胞分化影响的实验研究[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(8):1410-1413 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1410(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)08-01410-04

收稿日期:2007-09-12
修回日期:2007-11-10
(07-50-9-5207/GW·Q)

Influence of total saponins of panax notoginseng on the alcohol-induced differentiation of bone marrow stromal stem cells

Abstract

AIM:The total saponins of panax notoginseng can blockade the nature channel of calcospherite, increase the function about nitrogen monoxide of eurysma the vessel, and improve microcirculation and ischemia/reperfusion injury. The researches on the total saponins of panax notoginseng function on the prevention and treatment of alcohol-induced osteonecrosis are few. This study investigated the inhibitory effect of total saponins of panax notoginseng on differentiation of rabbit bone marrow stromal stem cells into adipocytes induced by alcohol.
METHODS: Experiments were conducted at Guangxi Medical University from November 2006 to August 2007. ①The total saponins of panax notoginseng was provided by Jiangsu Kangbao Pharmaceutic CO., LTD. (batch number: Z32020670). Rabbits aged 4 weeks were offered by Experimental Animal Center at Guangxi Medical University（cleanness grade）. The method we disposed in the experimental animal is consonant with animal ethical standard. ②The primary rabbit bone marrow stromal stem cells were isolated and cultured in vitro by density gradient centrifugation and adherence screening method. The 3rd passage cells were divided into 3 groups. Cells were cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum without alcohol or total saponins of panax notoginseng in a blank group. 0.09 mol/L alcohol was treated when culture medium was changed in a model group. 0.09 mol/L alcohol and 50 mg/L total saponins of panax notoginseng were treated when the culture medium was changed in a 50 mg/L total saponins of panax notoginseng group. 0.09 mol/L alcohol and 100 mg/L total saponins of panax notoginseng were treated when the culture medium was changed in a 100 mg/L total saponins of panax notoginseng group. ③The alkaline phosphatase activity and triglyceride level in the cells was measured.
RESULTS: ①At day 14, the alkaline phosphatase activity in cells in the model group was reduced, which was significantly lower than that in the other groups (P < 0.05). There was no significant difference in alkaline phosphatase activity in each group (P > 0.05). ②At day 21, the number of adipocytes in the model group was the most. The number of adipocytes was decreased in the total saponins of panax notoginseng groups (P < 0.05), and no adipocytes were found in the blank group. ③There was no significant difference between the two total saponins of panax notoginseng groups and blank group (P > 0.05). The triglyceride levels in the cells in the model group were the highest (P < 0.05).
CONCLUSION: Total saponins of panax notoginseng inhibit differentiation of bone marrow stromal cells into adipocytes induced by alcohol and enhance differentiation of bone marrow stromal stem cells into osteoblasts, which may prevent the development of alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head.

Wang DW, Pan H, Li HB, Wang HX, Chen YP, Gu GL.Influence of total saponins of panax notoginseng on the alcohol-induced differentiation of bone marrow stromal stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(8):1410-1413(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1410(ps).pdf]

0 引言

酒精所致的股骨头缺血坏死的在饮酒人群中发病率较低(约占0.3%)[1]，但是在首诊为股骨头缺血坏死的患者中,酒精性的可占31.8%[2]。长期、大量饮酒可抑制骨构建而促进骨吸收从而导致酒精性骨坏死[3]。罗玉琛等[4]研究表明日均饮酒量大于750 mL以上者,有导致股骨头缺血坏死的可能。有研究报道证实[5-7]，酒精可导致骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)向成脂分化,同时抑制其成骨分化,发生酒精性骨坏死。三七总皂苷是三七的主要活性成分,已有研究证实[8]，三七总皂苷能阻断受体操纵性钙通道、增强一氧化氮的扩张血管作用、改善微循环、具有抗缺血再灌注损伤的作用。而三七总皂苷对酒精性骨坏死的防治作用研究尚少。

1 材料和方法

设计：随机分组对照观察实验。
单位：广西中医学院附属瑞康医院。
材料：实验于2006-11/2007-08在广西医科大学完成。主要试剂：无水酒精（优级,分子式:CH3CH2OH，分子量: 46,汕头新宇化工厂）；三七总皂苷（江苏康宝制药有限公司,国药准字Z32020670）。
设计、实施、评估者：实验的设计为第一作者，实施为第二、三作者，第四作者负责实验动物的购买与饲养，第一、五、六作者负责评估，以上人员均经过系统培训。
方法：
兔骨髓基质干细胞的体外分离：4周龄大白兔由广西医科大学实验动物中心提供（动物质量合格证号：SCXK桂2003-0003），清洁级，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。以30%乌拉坦溶液耳缘静脉麻醉兔，接5 mL/kg体质量缓慢推注。用眼科剪备皮，络合碘消毒皮肤，切开皮肤、皮下组织，充分暴露下肢骨，无菌条件下用18号骨髓穿刺针穿破股骨干骺端。将预先吸含有625 U/mL肝素的无菌生理水1 mL注入骨髓腔，然后吸取骨髓液约3 mL，注入培养皿中保存，按上述操作共取股骨骨髓液约12 mL。以等体积的磷酸盐缓冲液稀释，用1 mL注射器反复吹打培养皿中的骨髓液约5 min，制成细胞悬液，注入含有等体积人淋巴细胞分离液的离心管中，800 r/min离心10 min。收集中间云雾状细胞层，再用磷酸盐缓冲液洗涤1次，去除多余的脂肪细胞及组织液，加入适量的含双抗的10%胎牛血清DMEM培养液吹打制成细胞悬液，置于离心管中，600 r/min离心10 min。弃上清液，加入足量含双抗的10%胎牛血清DMEM培养液，反复吹打，稀释成细胞悬液，以1×108 L-1密度接种于50 cm2培养瓶中。
兔骨髓基质干细胞的体外培养：将上述培养瓶置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中。48 h后首次换液，弃去未贴壁或已死去的细胞，继续培养，以后隔日换液。至8~12 d贴壁细胞融合为单层，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后按1∶2传代3次，并逐日用倒置显微镜观察其生长情况。
实验分组与处理：实验样本采用随机法分为4组：空白组:含10%胎牛血清DMEM培养基中培养, 不加酒精和三七总皂苷。模型组：每次更换培养液时加酒精0.09 mol/L。50 mg/L三七总皂苷： 每次更换培养液时，加酒精0.09 mol/L与50 mg/L三七

总皂苷。100 mg/L三七总皂苷:每次更换培养液时，加酒精 0.09 mol/L与三七总皂苷100 mg/L。
细胞内三酰甘油测定:细胞接种于6孔培养板内, 每组6个孔，每孔作为1个样本，以1×108 L-1的密度接种细胞,按上述方法施加实验因素，21 d终止培养。弃去培养液,PBS漂洗2次,细胞刮器收集贴壁的细胞，置入200 μL EP管中,加入100 μLPBS，采用超声波细胞粉碎机粉碎细胞,以3 000 r/min离心10 min，取上清液，用三酰甘油试剂盒在全自动生化分析仪上测定细胞内三酰甘油含量。
细胞内碱性磷酸酶活性及细胞总蛋白测定:将细胞接种于6孔培养板内,每孔加2 mL含10%胎牛血清的培养液。每组2板、共12孔，即每组12个样本。干预10 d终止培养，弃去培养液，PBS漂洗2次，细胞刮器收集贴壁的细胞。应用超声波细胞粉碎机粉碎细胞，以3 000 r/min离心10 min,取上清液在日本Olympus US640全自动生化分析仪上检测碱性磷酸酶活性。采用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测细胞内总蛋白含量。
主要观察指标：细胞内三酰甘油含量、碱性磷酸酶活性。
统计学方法：由第六作者采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。实验数据采用_x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 倒置显微镜下观察细胞变化 倒置显微镜下观察培养液中存在大量大小不等的圆形细胞，其中造血细胞为主要成分，随着培养时间的延长和培养液的更换，造血细胞逐渐死亡，在换液过程中被洗涤掉。吴学建等[9]通过实验亦发现在换液过程中死亡的造血细胞可以被洗涤掉。原代培养8 h骨髓基质干细胞开始贴壁生长，其他杂质细胞悬浮于培养基中；12 h后细胞贴壁生长，外观晶莹透亮，大小不等；3 d后贴壁细胞逐渐变为梭形并且增大，少数细胞呈现多角形，高培镜下可见细胞质丰富，细胞较大，呈椭圆形，位于中央，轮廓清晰，核内可见核仁存在，见图1，孔航等[10]通过实验观察亦有类似的报道；1周后大部分细胞贴壁延伸，体积变大，数目增多，多呈长梭形或三角形；第12天细胞呈集落生长，数目增多。张文元等[11]曾经报道：培养1周时细胞形成大量的小集落，细胞变长。此后集落细胞迅速增多，逐渐汇合成片，形态为均一的长梭形,呈旋涡状排列，见图2，2周时细胞长成单层。第3代骨髓基质干细胞培养至24 h贴壁均匀，然后开始实验干预,进行干预后48 h内无明显形态变化。5、7 d后可见三七总皂苷干预组细胞较空白组回缩变得细长，细胞间距增大,细胞数量稍有减少。干预14 d后模型组细胞内首先见到细小透亮油滴状物，显微镜在不同聚焦下亦可能为黑色高折光性颗粒，这与杨春喜等[12]所描述的基本一致即证实为脂滴形成。21 d后两三七总皂苷干预组也发现有脂滴出现但数目较少，脂滴直径较小。随干预时间延长两组内含脂滴逐渐增加,一些小脂滴逐渐增大融合，有的将胞核挤到胞质的一侧。空白组始终未见明显脂滴形成，见图3。

2.2 细胞内三酰甘油含量测定 50，100 mg/L三七总皂苷干预组和空白组中细胞内三酰甘油含量分别是(3.86±0.18) μg/孔、(3.80±0.19) μg/孔和(3.76±0.12) μg/孔，而模型组是(9.86±0.28) μg/孔。两三七总皂苷干预组和空白组间的差异无统计学意义(P > 0.05) ,而均与模型组的差异有统计学意义(P < 0.05)，两三七总皂苷干预组和空白组细胞内三酰甘油含量低于模型组细胞三酰内甘油含量。
2.3 细胞内碱性磷酸酶活性变化 50，100 mg/L三七总皂苷干预组和空白组细胞内碱性磷酸酶活性分别是(583.45±150.03) nkat/g蛋白质、(633.46±166.70) nkat/g蛋白质和(650.13±150.03) nkat/g蛋白质,而模型组是(416.75±133.36) nkat/g蛋白质。两三七总皂苷干预组和空白组间的差异无统计学意义(P > 0.05) ,而均与模型组的差异有统计学意义(P < 0.05)，两三七总皂苷干预组和空白组培养液中的碱性磷酸酶活性高于模型组碱性磷酸酶活性。

3 讨论

BMSCs在自然条件下主要分化为成骨细胞，在不同的培养条件下其分化途径不同，BMSCs在成骨细胞与成脂细胞分化之间呈反向变化[13-14]。
长期大量酒精摄入可导致酒精性骨病。研究证明,酒精能够促使骨内脂肪堆积，抑制成骨分化，导致成骨不足, 骨小梁稀疏、变细，骨密度降低，最终可发生骨质疏松或骨坏死[3]。有研究表明酒精对细胞的作用表现 在[15]：①较轻的毒害作用，细胞一般表现为适应性改变,酒精和其进一步的代谢产物通过信号转导而致细胞发生相应的改变如基因改变、形态改变、功能改变。低浓度的酒精以此种效应最为明显。②直接较重的毒害作用，表现为酒精的脂溶性作用和使蛋白质变性作用，严重的可以破坏细胞膜而致细胞死亡，高浓度的酒精以此种效应最为明显。Wang等[16]、Cui等[17]、Li等[18]、Pritchett等[19]对其防治激素性股骨头坏死的作用进行了细胞学、动物实验和临床研究,发现培养的细胞中转化为脂肪细胞的数量明显减少，成脂相关基因表达水平降低，成脂相关表型标记指标发生相应降低改变，而成骨相关基因表达水平升高,成骨相关表型标记指标发生相应增强改变，在体内能降低血脂水平，降低骨坏死的发生率，具有对抗激素作用而达到保护骨的作用。参考这些学者的研究结果，在本实验中采用50 mg/L和100 mg/L的三七总皂苷作为处理细胞的试剂。
基于酒精性股骨头坏死与激素性股骨头坏死在发病机制和病理在某些方面有很大的相同和相似性，而且骨质疏松是骨坏死的病理改变之一，三七总皂苷在骨质疏松的某一个或多个发病环节上起作用，从而阻止骨质疏松的发生和发展,故作者推测三七总皂苷应该对酒精性股骨头坏死也有防治作用并进行了细胞生物学研究。碱性磷酸酶是作为成骨细胞的一种特异表型，碱性磷酸酶增高在体外实验中作为成骨细胞分化的指标。
本实验结果提示在酒精作用后的BMSCs继续培养过程中，加入上述两种剂量的三七总皂苷可促进BMSCs的成骨表达,而抑制成脂表达。作者推测其机制是三七总皂苷促进BMSCs细胞向成骨细胞分化，抑制BMSCs向脂肪细胞转化，并干扰细胞脂代谢，从而降低了细胞内的胆固醇含量。增强细胞BMP-2表达水平，从而促进了成骨过程，表现为碱性磷酸酶活性增加,而这可能是三七总皂苷用于治疗骨坏死时促进骨修复的一种重要机制。

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