课题背景：课题以人非家族性乳腺癌癌旁组织中分离的成体乳腺干细胞为对象，经原代培养，免疫磁珠分离，单细胞培养，连续转染猿病毒40大T抗原片段后能够连续传代约2～4个月，经免疫组化和印记杂交鉴定细胞表达ESA抗原及K19，而不表达sialomucin，在三维培养中表现出形成腺泡结构的功能。采用反转录PCR及免疫印记杂交方法，观察干细胞及癌组织中乳腺癌相关基因的表达，及染色体部分位点的基因组不稳定性。现阶段成果显示乳腺干细胞无相应癌基因表达、抑癌基因变异或缺式，可以证明乳腺干细胞不具有恶性变的分子基础。

同行评价：各种干细胞的增殖与分化调控是干细胞研究的重要课题，乳腺干细胞有分化成乳腺各种上皮细胞及形成乳腺腺体结构的能力。本实验探讨黄芪和丹参对体外培养的乳腺干细胞增殖的影响，发现合适浓度的单药可以促进乳腺干细胞增殖，且两种药物联合使用产生协同效果，对乳腺干细胞的最终应用有一定积极意义。

偏倚或不足：①实验检测技术较单一，仅采取MTT比色法分析不同剂量黄芪和丹参对体外分离培养的乳腺成体干细胞增殖的影响，缺乏更深层次的分析。②实验重复性未得到论证。③药物中起作用的主要成分、联合协同作用的机制尚不清楚。

1吉林大学第一医院乳腺外科，吉林省长春市 130021；2吉林省肿瘤医院乳腺外科，吉林省长春市 130021；3吉林大学公共卫生学院放射生物实验室，吉林省长春市 130021

王 蕾☆，女，1979年生，吉林省吉林市人，汉族，吉林大学第一医院在读博士，主治医师，主要从事乳腺疾病基础及临床方面的研究。
wanglei2322@
163.com

通讯作者：石爱平，博士，主治医师，吉林大学第一医院乳腺外科，吉林省长春市 130021
sap1225@yahoo.
com.cn

国家自然科学基金（30300336）*

摘要
目的:文献报道黄芪和丹参均可诱导间质干细胞向神经细胞分化。实验以乳腺癌患者乳腺再生为最终目的，通过MTT比色法分析不同剂量黄芪和丹参对体外分离培养的乳腺成体干细胞增殖的影响。
方法：实验于2006-09/2007-09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室完成。①对象：女性非家族性乳腺癌癌旁病理证实为正常的乳腺组织取自吉林大学第一医院乳腺外科，共24例，患者年龄29～45岁，对治疗及实验均签署知情同意书。②实验方法：取切除的正常乳腺组织，去除血管及脂肪，剪碎至1.0 mm3块，组织块消化培养传代后应用免疫磁珠分离收集MUC-、ESA+标记的细胞，即乳腺成体干细胞，按1×108 L-1密度接种于96孔培养板，无血清培养48h后更换培养基，设立4组：空白对照组不加任何药物；黄芪注射液组分为25，50，100，200 mL/L 4个亚剂量；丹参注射液组分为12.5，25，50，100 mL/L 4个亚剂量；黄芪+丹参复合注射液组分为（25+12.5）,(50+25),（100+50）,（200+100）mL/L 4个亚剂量。③实验评估：各组加入对应药物后培养72 h，加入5 g/L MTT溶液20 μL，再加入二甲基亚砜振荡溶解，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度值，分析乳腺干细胞的增殖情况。
结果：①乳腺细胞形态观察：乳腺组织原代培养后形成腺上皮细胞和肌上皮细胞。②乳腺干细胞增殖检测：黄芪注射液以 50 mL/L为界，剂量越小对乳腺成体干细胞的促增殖作用越强（P < 0.01），达200 mL/L时产生抑制作用（P < 0.05）。丹参注射液剂量在12.5~100 mL/L范围内变动时，均能够促进乳腺成体干细胞的增殖（P > 0.05）。黄芪与丹参复合注射液以（100+ 50）mL/L为界，复合剂量越小对乳腺成体干细胞的促增殖作用越强（P < 0.01），且复合用药效果好于单独用药，当剂量达到（200+100）mL/L时产生抑制作用（P < 0.05）。
结论：丹参和小剂量黄芪均可提高体外分离培养的乳腺干细胞增殖能力，且两药低剂量联合使用促增殖作用更为明显。
关键词：乳腺成体干细胞；黄芪；丹参；细胞培养

王蕾，张科伟，赵大伟，付士波，刘国津，石爱平. MTT法检测黄芪和丹参对人乳腺干细胞体外增殖的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(8):1418-1421 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1418(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)08-01418-04

收稿日期: 2007-10-10
修回日期: 2007-12-10
(07-50-10-5430/ZS·Y)

Effects of radix astragali and salvia miltiorrhiza bunge on the proliferation of human mammary stem cells detected with MTT chromatometry

Abstract

AIM:It is reported that radix astragali (RA) and salvia miltiorrhiza bunge (SMB) can induce mesenchymal stem cells differentiate into nerve cells. This study analyzed the effects of RA and SMB on the proliferation of the adult mammary stem cells cultured in breast cancer patients by means of MTT chromatometry.

METHODS: The experiment was done in the Radio-biochemical Laboratory, Public Health College of Jilin University during September 2006 to September 2007.①Twenty-four female patients who haven't familial breast cancer, aged 29-45 years, were adopted in the study. The glandular tissue obtained from Department of Mammary Surgery in the First Hospital of Jilin University, all the patients had signed informed consent.②Vessel and fat were removed from the normal mammary gland tissues which had been excised, and then crushed into pieces of 1.0 mm3. After digestion, cultivation and purification by immunomagnetic sorting, the mammary adult stem cells labeled with MUC- and ESA+ were harvested and inoculated into a 96-well culture plate. Serum-free culture medium was changed 48 hours later, and divided into four groups: blank control group was untreated; RA group was added with different concentrations of RA (25, 50, 100, 200 mL/L); SMB group was added with different concentrations of SMB (12.5, 25, 50, 100 mL/L); Combined group was added with RA and SMB [(25+12.5), (50+25), (100+50), (200+100) mL/L].③After the cells were cultured for 72 hours, 5 g/L MTT solution (20 μL) was added, then dimethyl sulfoxide was used for vibration and dissolvement. Optical density of each hole was detected by using enzyme-linked immunosorbent assay to analyze different concentrations of RA and SMB on the proliferation of human mammary stem cells.

RESULTS: ①Morphous of the mammary cells: The tissues formed glandular epithelial cells and myoepithelial cells after the primary culture.②Proliferation of the mammary cells: With 50 mL/L as a boundary, RA could promote the proliferation of human mammary stem cells, and the smaller the dosis was, the better the effect was (P < 0.01), 200 mL/L brought about inhibition (P < 0.05). SMB could promote the proliferation of human mammary stem cells at the range of 12.5-100 mL/L (P > 0.05). Starting from (100+ 50) mL/L, the combination of RA and SMB could promote the proliferation of human mammary stem cells, the smaller dosis indicated the better effect (P < 0.01), and the combination was superior to the single use. (200+100) mL/L combination brought about inhibition (P < 0.05).

CONCLUSION: SMB and small dose of RA can promote the proliferation of human mammary stem cells. The effect is more obvious when RA and SMB combined at small dose.

Wang L, Zhang KW, Zhao DW, Fu SB, Liu GJ, Shi AP.Effects of radix astragali and salvia miltiorrhiza bunge on the proliferation of human mammary stem cells detected with MTT chromatometry.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(8):1418-1421(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1418(ps).pdf]

0 引言

近年来对于中药诱导间质干细胞向神经细胞分化的研究一直是备受关注的问题。利用干细胞技术，可以再造多种正常的甚至更年轻的组织器官。2002年3月，Peterson[1]首先宣布成功分离培养了成人乳腺干细胞；2006年，Visvader等[2-3]宣布通过一个干细胞培育出了一个具有功能的乳腺，这些研究为实现干细胞乳腺再生提供了理论和实践基础。有文献报道黄芪和丹参均可促进干细胞的增殖、诱导其定向分化[4-6]，本实验以乳腺癌患者乳腺再生为最终目的，探讨黄芪和丹参对于体外分离培养的乳腺干细胞增殖的影响。

1 材料和方法

设计：细胞观察实验。
单位：吉林大学第一医院乳腺外科，吉林省肿瘤医院乳腺外科，吉林大学公共卫生学院放射生物实验室。
材料：实验于2006-09/2007-09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室完成。①对象：女性非家族性乳腺癌癌旁病理证实为正常的乳腺组织取自吉林大学第一医院乳腺外科，共24例，患者年龄29~45岁，对治疗及实验均签署知情同意书。②主要仪器与试剂：MiniMACS免疫磁珠分离器（Miltenyi Biotec，德国）；紫外分光光度仪（SHIMADZU，日本）；倒置显微镜（OLYMPUS，日本）；DMEM/F12 1∶1培养基（Hyclone，美国）；青霉素，链霉素，两性霉素B，Ⅰ型胶原酶（Invitrogen，美国）； BSA(Gibco，美国)；EDTA(Invitrogen，美国)；标准胎牛血清（tbd，天津灏洋）；人表皮生长因子（Invitrogen，美国）；Muc-1（NeoMarkers，美国）；ESA（Invitrogen，美国）；羊抗鼠IgG微珠（Miltenyi Biotec，德国）；MTT（Sigma，美国）。
设计、实施、评估者：实验设计、干预实施为第一作者，结果评估为第六作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
相关培养基的配置：①基础培养基：含青霉素50 mg/L，链霉素100 mg/L，两性霉素B 2.5 mg/L，氢化可的松0.5 mg/L，胰岛素5 mg/L的DMEM/F12 1∶1培养基。②消化培养基：青霉素 50 mg/L，链霉素100 mg/L，两性霉素B 2.5 mg/L，Ⅰ型胶原酶0.2 g/L的DMEM/F12 1∶1培养基。③免疫磁珠用磷酸盐缓冲液：0.01 mol/L，含 2 mmol/L EDTA，0.5% BSA。
乳腺细胞的原代培养及传代：取切除的乳腺组织中远离肿瘤并经病理证实的正常组织，用无菌剪刀去除血管及脂肪组织，生理盐水漂洗后，加少量基础培养基，在培养皿中轻柔剪碎至 1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm或更小，转移至离心管中，生理盐水冲洗3次，1 200 r/min离心5 min，弃上清，转移至含有5 mL消化培养基的25 mL塑料培养瓶中，各培养瓶编号后置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度下消化20 h，1 200 r/min离心 5 min，弃去消化培养基，将组织块转移至含有10%胎牛血清的基础培养基中继续培养，第2~3天换液将组织块倒掉，以后每3 d换液1次，每次换液时加20 mg/L表皮生长因子。10~14 d后细胞铺满整个培养瓶表面时，先用D-Hank’s冲洗，再用2.5 g/L胰酶于37 ℃消化15~20 min，按1∶3传代。
应用免疫磁珠分选乳腺干细胞：乳腺细胞经

可进行免疫磁珠分离。消化过程与前相同，细胞数约为1×1010 L-1，以300 g离心10 min，将细胞悬浮于加有5 μL MUC-１和95 μL磷酸盐缓冲液中，4 ℃磁性标记 30 min，300 g离心10 min，弃上清，向1×1010 L-1细胞中加1.0~2.0 mL缓冲液冲洗，300 g离心10 min，再将细胞悬浮于加有20 μL羊抗鼠IgG微珠和80 μL磷酸盐缓冲液中，4 ℃孵育20 min，冲洗离心后，将细胞再悬浮于500 μL缓冲液中准备磁性分离。安装免疫磁珠架，向磁柱中加入500 μL缓冲液清洗磁柱，待缓冲液将滴尽时将500 μL细胞悬液沿磁柱壁小心加入，注意不可产生气泡，再加3×500 μL缓冲液，收集滴下的所有液体作为MUC-标记的细胞。取下磁柱，加入1 mL缓冲液，用注射器针芯将磁柱中细胞压出，收集作为MUC+标记的细胞。MUC-标记的细胞冲洗离心后，将细胞悬浮于加有20 μL ESA和80 μL磷酸盐缓冲液中，4 ℃磁性标记过夜后，同上方法加二抗孵育，磁性分离，最后收集MUC-、ESA+标记的细胞（图1），细胞计数，一般约为1×108 L-1。

乳腺干细胞增殖MTT比色法检测：取磁珠分离后乳腺干细胞，按1×108 L-1密度接种于96孔培养板中，每孔含细胞悬液100 μL，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度下无血清培养48 h，细胞完全贴壁后，更换培养基。设立4组：空白对照组不加任何药物；按Limberg[7]推荐的公式参照临床药物剂量计算药物的血浆高峰浓度，选用血浆高峰浓度的0.5，1，2，4倍的药物浓度为测试浓度范围，因此黄芪注射液组分为25，50，100，200 mL/L 4个亚剂量；丹参注射液组分为12.5，25，50，100 mL/L 4个亚剂量；黄芪+丹参复合注射液组分为（25+12.5），（50+25），（100+50），（200+100）mL/L 4个亚剂量。每种剂量设6个复孔，各组加入对应药物后培养72 h，加入5 g/L MTT溶液20 μL，在37 ℃孵箱中培养4 h，弃除孔内上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡30 min使沉淀充分溶解后，选择590 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度（A）值。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0软件进行t检验分析，数据均以_x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 乳腺细胞形态观察 乳腺组织经原代培养后，形成两类形态不同的细胞，分别为腺上皮细胞和肌上皮细 胞[8]。腺上皮细胞相对弥散，呈圆形或立方形，细胞界限不清；肌上皮细胞排列紧密呈长梭形，细胞间存在明亮的折射角，界限清晰。经胶原酶消化的乳腺组织培养3 d后，在贴壁的组织块或细胞团周围有游离出的单个细胞（图2）；7 d时细胞逐渐成团，并向周围扩展，随培养时间的延长细胞密度逐渐增加，增殖旺盛，融合成片，腺上皮细胞逐渐向肌上皮细胞转化（图3）。

2.2 乳腺干细胞增殖MTT比色法检测结果 黄芪注射液以50 mL/L为界，剂量越小对乳腺成体干细胞的促增殖作用越强（P < 0.01），剂量增大时无明显变化，达200 mL/L时产生抑制作用（P < 0.05）。丹参注射液剂量在12.5~100 mL/L范围内变动时，均能够促进乳腺成体干细胞的增殖，促进作用差异无显著性意义（P > 0.05）。
黄芪与丹参复合注射液以（100+50）mL/L为界，复合剂量越小对乳腺成体干细胞的促增殖作用越强（P < 0.01），且复合用药效果好于单独用药，当剂量达到（200+100）mL/L时对乳腺成体干细胞产生抑制作用 （P < 0.05）。见表1。

3 讨论

本试验应用免疫磁珠法分离标记为MUC-、ESA+的乳腺细胞，此类细胞经Peterson证实具有乳腺干细胞特性，能在裸鼠体内再生出具有功能的乳腺。研究证实[9]，这种取自乳腺癌旁正常组织中的乳腺干细胞不具有异常增殖、分化的分子基础，不具有恶性变化的趋势，是接近正常的细胞，可以用于进行乳腺癌分子机制及乳腺再造的研究。
随着对间质干细胞生物学特性研究的深入，近年来有关中药对其诱导分化功能影响的研究也屡见报道。其中丹参可活血化淤、黄芪能益气扶正，研究表明向贫血小鼠体内注射黄芪注射液后，对小鼠造血干细胞的增殖有明显促进作用[10]。黄芪能够促进血管内皮前体细胞的增生，临床上可与自体骨髓干细胞移植联合用于治疗下肢慢性缺血性疾病[11]。黄芪甲苷可在体外诱导大鼠间质干细胞定向分化为心肌样细胞[12]。黄芪还能诱导表皮干细胞增殖，具有构建组织工程皮肤、完整修复皮肤结构和功能的应用前景[13]。用中药丹参联合神经生长因子成功地诱导了骨髓间质干细胞向神经细胞的体外定向诱导分化[14-16]。低剂量的复方丹参制剂可以促进血管内皮前体细胞的增生[17]。在骨髓腔内输注复方丹参注射液可直接刺激骨髓腔内面的骨内膜及红骨髓造血，有利于造血干细胞生长和发育，用于再生障碍性贫血的治疗[18]。中药黄芪（Radix Astragali）为豆科多年生草本植物膜夹黄芪和蒙古黄芪的根，味甘，性微温，具有补气升阳、益卫固表、利尿消肿、脱毒生肌的功效；丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为常用重要中草药，丹参的菲醌类化合物有较好的消炎抗菌作用，尤其对冠状动脉粥样硬化性心脏病、心绞痛等心血管疾病有良好的疗效。

本课题组通过MTT比色法分析黄芪和丹参对于体外培养的乳腺干细胞增殖的影响，结果发现丹参和小剂量黄芪均可促进乳腺干细胞的增殖，而两药低剂量联合使用对体外培养的乳腺干细胞增殖促进作用更为明显。这些结果提示乳腺成体干细胞的体外培养可以联合中药制剂以提高其增殖分化的能力，为进一步研究乳腺癌发生发展机制及应用乳腺成体干细胞实现乳腺再生提供良好的实验基础。

4 参考文献

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