膀胱匀浆上清液在大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为平滑肌样细胞中的作用☆

王振显1，蔡文清1，宋永周2，瞿长宝1，史正亮2，郭威3

课题背景：作者前期实验采用10%的二甲亚砜联合成纤维细胞生长因子成功的将大鼠骨髓间充质干细胞诱导为神经元样细胞，但7 h后细胞即开始死亡，24 h后大部分细胞已经脱离培养瓶瓶底，说明高浓度化学诱导剂对细胞有毒性作用。膀胱匀浆上清不是化学制剂，而1%二甲亚砜为低浓度化学制剂，对细胞均无明显毒性作用。

相关链接：近年来的研究表明，环境因素在干细胞分化过程中起关键作用。Jang等应用受损伤的肝脏组织匀浆与造血干细胞进行非接触性嵌合培养，在体外诱导造血干细胞向肝脏上皮分化过程中细胞表面出现肝脏上皮细胞特异标记的表达。国内杨景全等报道，大鼠脊髓匀浆上清液可在体外有效地诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞。张婷等也报道，在缺血再灌注损伤大鼠肾脏匀浆诱导下，骨髓干细胞可向肾小管上皮样细胞分化。骨髓间充质干细胞在体内分化为何种细胞，可能受很多因素的影响，其所处微环境的改变、宿主对其的诱导趋化作用及其可能分泌的某些趋化因子、生长因子等可能是很重要的诱导因素。

应用要点：骨髓干细胞在体外经诱导可分化为平滑肌细胞,文献报道的诱导剂多为血小板衍生生长因子、转录生长因子以及平滑肌细胞共培养等。本实验采用首先应用低浓度的二甲亚砜（1%DMSO）对大鼠骨髓间充质干细胞进行初诱导8 h，然后应用膀胱匀浆上清液再诱导7d，通过改变干细胞生存的微环境，成功地将骨髓间充质干细胞诱导分化为平滑肌样细胞。

河北医科大学第二医院，1泌尿外科，2骨科，河北省石家庄市 050051；3河北医科大学解剖教研室，河北省石家庄市 050017

王振显☆，男，1971年生，河北省晋州市人，汉族，河北医科大学在读博士，副主任医师，副教授，主要从事细胞培养和组织工程膀胱的研究。
qianqianhu1998@
yahoo.com.cn

通讯作者：蔡文清，教授，博士生导师，河北医科大学第二医院泌尿外科，河北省石家庄市 050051

摘要
目的:环境因素对干细胞的分化起到重要的作用。实验拟观察经低浓度二甲亚枫进行预诱导后，大鼠骨髓间充质干细胞在体外经膀胱组织匀浆上清液诱导定向分化为平滑肌样细胞的可行性。
方法：实验于2007-04/2007-09在河北医科大学解剖教研室下属细胞培养室完成。①实验材料：4～6周龄100～150 g健康清洁级SD大鼠1只，雌雄不限，8周龄220~250 gSD大鼠4只，由河北医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：采用骨髓干细胞培养基和贴壁法从SD大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞，并在体外扩增、传代。选择8周龄SD大鼠进行膀胱组织上清液的制备。取第4代骨髓间充质干细胞用1%二甲亚砜预诱导8 h后，应用膀胱匀浆上清液诱导7 d。以未进行诱导的骨髓间充质干细胞为阴性对照组。③实验评估：观察细胞形态学的变化，并运用免疫细胞化学检测特异性α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。
结果：骨髓间充质干细胞经诱导分化后，细胞呈梭形平滑肌样，融合后形成峰谷状排列，并表达平滑肌特异性蛋白标志物α－平滑肌肌动蛋白，诱导分化率为（45.6±3.5）%，与阴性对照组相比差异具有显著性意义（P < 0.05）。
结论：采用此方法成功诱导骨髓间充质干细胞分化为平滑肌样细胞。
关键词：干细胞；平滑肌；细胞培养；分化

王振显，蔡文清，宋永周，瞿长宝，史正亮，郭威.膀胱匀浆上清液在大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为平滑肌样细胞中的作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(8):1422-1425(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1422(ps).pdf]

中图分类号: R318.4
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)08-01422-04

Rat bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into smooth muscle cells in vitro induced by the supernatant of homogenized bladders

AIM:Environmental factors play important roles in the differentiation of stem cells. This study explored the potential of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) to differentiate into smooth muscle cells by the supernatant of homogenized bladder.

METHODS: The experiment was conducted in the cell culture laboratory affiliated to the Department of Anatomy, Hebei Medical University from April to September 2007. ①One 4-week-old healthy SD rat of 100-150 g, either male or female, and four 8-week-old SD rats of 220-250 g were provided by the experimental animal center of Hebei Medical University. All procedures employed in this study were consistent with the animal ethical standards. ②MSCs were isolated from SD rat bone marrow by total marrow culture associated with attachment method, purified and cultured in vitro. The supernatant of homogenized bladder was made with 8-week-old SD rats. The MSCs of the 4th generation were cultured in DMEM with 1% dimethyl sulfoxide (DMSO) for 8 hours before changing the supernatant of homogenized bladders to induce differentiation for 7 days. MSCs not treated served as negative control. ③Morphology of cells was observed and immunocytochemistry was performed to detect the expression of specific α-smooth muscle actin (SMA).

RESULTS: After induction, MSCs showed smooth muscle-like cells and spindle-shaped. The cells fused as a hill-and-valley growth pattern, and expressed the specific α-SMA. The differentiation rate was (45.6±3.5)%, which was statistically significant compared with negative control group (P < 0.05).

CONCLUSION: MSCs are induced into smooth muscle cells in vitro by this method.

Wang ZX, Cai WQ, Song YZ, Qu CB, Shi ZL, Guo W.Rat bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into smooth muscle cells in vitro induced by the supernatant of homogenized bladders.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(8):1422-1425(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1422(ps).pdf]

近年来的研究表明干细胞作为组织材料对生物组织工程及医学的发展有着巨大影响，是目前科学界广泛关注的课题。骨髓间充质干细胞是来源于中胚层的一类干细胞，主要存在于骨髓及其他结缔组织，不仅具有向中胚层分化的能力，而且具有向内胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力，在特定条件下可定向分化为骨、肌肉、血管内皮和神经等多种终末功能的细胞，作为组织工程的种子细胞得到越来越广泛的关注[1-3]。骨髓干细胞在体外可分化为平滑肌细胞已见文献报道，但诱导剂各不相同[4-7]。

设计：开放性实验。
单位：河北医科大学第二医院泌尿外科。
材料：实验于2007-04/2007-09在河北医科大学解剖教研室下属细胞培养室完成。选取4~6周龄100~150 g健康清洁级SD大鼠1只，雌雄不限，8周龄220~250 g大鼠4只，由河北医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。L-DMEM（Sigma公司），胎牛血清（北京元亨圣马公司）、0.25%胰蛋白酶（Sigma公司）,PBS液，二甲基亚砜（DMSO，美国R&D公司），小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白一抗，山羊抗小鼠二抗。日本OLYMPUS荧光倒置显微镜IX71和光学显微镜CX31。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者，干预实施与评估为第一、三、四、五、六作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离与原代培养：4~6 周龄大鼠1只，应用0.6%水合氯醛以0.5 mL/100 g的标准进行腹腔注射麻醉，无菌条件下取大鼠双侧股骨、胫骨和胸骨，并用含有双抗（青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL）的L-DMEM培养基冲出骨髓于离心管中，吹打制成单细胞悬液，离心去除上清及脂肪，用含10%FBS、100 U/mL双抗的L-DMM培养基重悬。将细胞接种于培养瓶中，37 ℃、5%CO2环境下进行培养，3 d后首次半量换液，去除未贴壁细胞。5 d后全量换液。以后每三四天换液1次，待细胞达95%融合时，用0.25%的胰酶消化2.0~3.0 min后进行传代。倒置显微镜下观察原代及传代后的细胞生长特点。
大鼠膀胱组织匀浆上清液的制备：8周龄大鼠4只，麻醉后行下腹部切口取出膀胱，立即用4 ℃ 0.01 mol/L的PBS液冲洗，并置于8 mL 4 ℃ 0.01 mol/L 的PBS液中进行匀浆、离心 (2 000 r/min，10 min)，取上清液用0.2 μm的针头滤器过滤，-20 ℃下冷冻保存备用。
大鼠膀胱匀浆上清液对骨髓间充质干细胞的诱导分化：取第4代骨髓间充质干细胞以2×107 L-1密度接种于预置盖玻片的6孔培养板中培养2 d，使细胞贴壁。吸出培养基，换入含有1%DMSO的培养基预诱导8 h，然后换入膀胱匀浆上清液与DMEM为1∶1的混合培养基培养7 d。期间换液1次。

覆有细胞的盖玻片用0.01 mol/L的PBS洗涤3次，用4 ℃ 4%的多聚甲醛固定至少30 min，PBS洗涤，0.2%的Triton X-100室温浸泡15 min，3%H2O2室温封闭 15 min，PBS再洗涤，正常山羊血清封闭，37 ℃孵育 60 min，加α-平滑肌肌动蛋白一抗，4 ℃过夜，滴加生物素化二抗工作液、辣根过氧化物酶标记的三抗工作液，DAB染色，苏木精复染，中性树胶封固。以未进行诱导的骨髓间充质干细胞为阴性对照，进行同样的染色处理。光学显微镜下观察。
主要观察指标：①应用倒置显微镜观察干细胞以及诱导后细胞的生长特点。②采用平滑肌细胞特异性蛋白标志物（SM-α-actin）进行诱导后细胞的鉴定。
统计学方法：统计学处理由第一作者完成。数据用SPSS 11.0软件处理，各组实验数据以_x±s表示，组间比较用单因素方差分析。

2.1 骨髓间充质干细胞的形态学特征原代培养的骨髓细胞成分复杂,一二天开始有少量细胞贴壁，形状不规则，有长梭形、多角形等。半量换液后，细胞开始迅速增殖，以集落形式生长为主。7~9 d细胞长满瓶底，达95%以上融合，主要呈纺锤形其中散在少量折光性强的小圆形细胞。细胞整体排列趋于规律性，呈旋涡状，辐射状或鱼群样排列，见图1。

2.2 诱导后骨髓间充质干细胞的形态学改变诱导分化7 d后骨髓间充质干细胞转变为梭形平滑肌样的细胞，细胞变大，胞膜清晰，无空泡，可重叠生长，融合后形成峰谷排列，呈良好的去分化状态，见图3。

2.3 诱导后细胞的鉴定 1%二甲基亚砜联合膀胱匀浆上清诱导骨髓间充质干细胞7 d后，部分细胞表现为SM-α-actin染色阳性，胞浆呈现棕黄色，见图4。随机计数10个视野计算诱导分化率为(45.6±3.5)%。未进行诱导的骨髓间充质干细胞亦有少量细胞SM-α-actin染色阳性(3.8±0.77)%。经统计学分析，实验组和阴性对照组的SM-α-actin染色阳性率比较有显著性差别（P < 0.05）。

组织工程学是近年来新兴起的一门学科，受到了科学界的广泛关注。其核心是利用组织工程学技术与生命科学的成果，将活细胞与生物材料结合，修复、重建、维持、恢复或提高人体组织的功能[8]。没有复合细胞的单纯的生物材料用于组织替代已多见报道。例如，小肠黏膜下层已经用于膀胱的修补，并已经用于神经、血管、肌腱、腹壁等组织缺损的修复[9-15]。但是工程化组织的构建需要将大量活性良好的种子细胞种植到适合的生物材料上，形成具有生物活性的组织替代材料。组织工程膀胱采用的种子细胞多为平滑肌细胞和移行细胞，进行支架材料双面种植[16]。各种资料及临床经验提示移行上皮细胞具有很强的再生及修复能力，而平滑肌细胞则需要种植。但是平滑肌细胞取材培养困难，且体外传代有限。目前的研究认为[17]，骨髓中除含有造血干细胞外，还有另外一类细胞，即骨髓间充质干细胞，具备多向分化潜能，具有跨系统分化的可塑性。但应用贴壁方法得到的骨髓间充质干细胞并不是成分均一的细胞，还含有成纤维细胞和内皮细胞、脂肪细胞等等。经过反复传代纯化，3代后的细胞形态趋于一致，所以应用4代细胞进行实验。由于SM-α-actin是平滑肌细胞的主要标志，而且实验中其阳性率最高，故选其为主要观测指标。但经反复实验，SM-α-actin有较高的假阳性率，因此将细胞胞浆虽黄染但染色较淡的2个细胞作为1个阳性细胞进行计数。结果显示，实验中的阴性对照组（未进行诱导的MSCs）亦有少量细胞SM-α-actin染色阳性（3.8± 0.77）%,说明干细胞在增殖过程中有自主向其他类型细胞分化的行为。而诱导组分化率为（45.6±3.5）%，与阴性对照组相比有显著性差异（P < 0.05），说明经过干预，可明显增加干细胞向平滑肌细胞的转化率。
5-氮杂胞苷和二甲亚砜是目前间充质干细胞向成肌细胞诱导分化研究中常用的诱导剂，但其诱导干细胞分化为心肌、骨骼肌细胞的作用较强，向平滑肌作用的诱导作用较弱，而且浓度和诱化后的细胞活性比较难以掌握。有文献报道5-氮杂胞苷浓度越高，诱导的作用越强，但较高的毒性作用也相应增加[18]。本实验室曾用10%的二甲基亚砜联合成纤维细胞生长因子成功的将大鼠骨髓间充质干细胞诱导为神经元样细胞，但7 h后细胞即开始死亡，24 h后大部分细胞已经脱离培养瓶瓶底。以上均说明高浓度化学诱导剂对细胞的毒性作用。膀胱匀浆上清不是化学制剂，而1%二甲基亚砜为低浓度化学制剂，所以细胞均无明显的毒性作用。本实验应用低浓度二甲基亚砜进行预诱导，然后应用膀胱匀浆上清液对干细胞进行诱导，成功的将骨髓间充质干细胞分化为平滑肌样细胞，初步证实该方法的可行性，有望为组织工程膀胱提供丰富的种子细胞。
近年来的研究表明，环境因素在干细胞分化过程中起关键作用。Jang等[19]应用受损伤的肝脏组织匀浆与造血干细胞进行非接触性嵌合培养，在体外诱导造血干细胞向肝脏上皮分化过程中细胞表面出现肝脏上皮细胞特异标记的表达。国内杨景全等[20]报道，大鼠脊髓匀浆上清液可在体外有效地诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞。张婷等[21]也报道，在缺血再灌注损伤大鼠肾脏匀浆诱导下，骨髓干细胞可向肾小管上皮样细胞分化。骨髓间充质干细胞在体内分化为何种细胞，可能受很多因素的影响，其所处微环境的改变、宿主对其的诱导趋化作用及其可能分泌的某些趋化因子、生长因子等可能是很重要的诱导因素。膀胱匀浆组织大部分是膀胱平滑肌组织和移行上皮组织，其上清液则可能含有平滑肌和移行上皮细胞存活、生长的某些细胞因子等，如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子及转录生长因子等，对干细胞的分化起到重要的作用。同时，这种诱导剂不含有化学诱导剂的毒性作用。

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