课题背景：课题主要是与原上海第二医科大学发育生物学中心实验室合作的课题，同时也得到黑龙江省自然基金、省教育基金资助。前期的实验工作主要是胚胎干细胞移植修复脊髓损伤的实验研究，论文已发表，主要研究不同种类的干细胞修复脊髓损伤疗效分析及机制探讨。

相关链接：脊髓损伤治疗领域研究热点和重点主要是证实干细胞移植治疗脊髓损伤的有效性，以及探讨这些干细胞是否分化为神经细胞，是否提高脊髓的功能。目前在脊髓损伤亟待解决的问题主要明确脊髓损伤的机制，即是有哪些基因和神经生长因子及各种蛋白在起作用及对干细胞对这些基因是否有调控作用。

应用要点：现已有很多有关干细胞治疗脊髓损伤的相关文章报道，但对骨髓单个核细胞治疗脊髓损伤报道还很少，作者选择此切入点进行研究，实验证实其移植的单个核细胞移植后是有效的，同时也发现骨髓单个核细胞能在受损的脊髓内存活且能分化为血管的标志，这个结果提示在脊髓急性损伤的过程中，骨髓单个核细胞能分化为新生的血管，这对急性脊髓损伤的治疗是非常重要的。

佳木斯大学附属第一医院骨外一科, 黑龙江省佳木斯市
154002

李长德，男，1958年 生，黑龙江省 桦 南 县人，汉族，1982年佳木斯医学院毕业，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事干细胞在脊髓损伤中的应用研究。
jianhua01@163.
com

通讯作者：杨建华，佳木斯大学附属第一医院骨外一科，黑龙江省佳木斯市 154002

黑龙江省自然科学基金（D2007-91）
项目*

摘要
目的:研究已证实，各种干细胞移植治疗损伤脊髓，都可以一定程度的恢复脊髓中枢神经的功能。但对骨髓单个核细胞移植治疗损伤脊髓以及长期效果的研究少见。利用大鼠抽取新鲜分离的骨髓单个核细胞,将其移植入脊髓损伤大鼠模型,评价脊髓功能恢复情况、神经再生和新生血管形成及长期预后效果。
方法：实验于2005-10/2006-04在上海第二医科大学发育生物学研究中心实验室完成。实验室级别：生物安全一级。①实验材料：8周龄SD雌性大鼠，体质量200~220 g，清洁级，由中国科学院实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：从大鼠胫骨及股骨采集骨髓细胞,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞备用。制作大鼠脊髓损伤动物模型，将造模成功22只大鼠随机分成2组:模型+细胞组（n =11）：脊髓完全横断T9~10后，椎管内注射骨髓单个核细胞；模型+DMEM组（n =11）：脊髓完全横断T9~10后在损伤邻近区注射DMEM。假手术组（n =9）：仅剪除T9-10棘突和椎板后，不损伤脊髓，逐层缝合。③实验评估：采用原位杂交和免疫组织化学技术检测移植细胞在宿主脊髓内的存活情况，BBB评分评估大鼠脊髓神经功能恢复情况。
结果：①假手术组在术后各时间点观察中评分无明显差异，属评分正常。模型+DMEM组评分为0分，其脊髓功能无明显恢复。模型+细胞组在2，4，6，8周脊髓功能处于逐渐恢复的过程。与模型+DMEM组及假手术组比较，差异有显著性意义 (P < 0.01)。②原位杂交和免疫组织化学检测显示，移植的细胞能在宿主体内存活，并嵌合到宿主脊髓组织表达血管标志。
结论：骨髓单个核细胞移植后8周，不仅能够在损伤脊髓内存活，而且还能分化新生血管，促进脊髓功能的恢复。
关键词：急性脊髓损伤；骨髓单个核细胞；细胞移植

李长德，杨建华，刘铮，李东平．骨髓单个核细胞移植治疗急性脊髓损伤[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，8(8):1431-1434 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1431(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)08-01431-04

收稿日期:2007-09-07
修回日期:2007-11-12
(07-50-9-4886/GW·Q)

Bone marrow mononuclear cell transplantation in the treatment of acute spinal cord injury

Abstract

AIM:Some researches show that stem cell transplantation for damaged spinal cord can improve the function of damaged spinal cord. But the studies about bone marrow mononuclear cell transplantation for injuried spinal cord are seldom. We transplanted fresh bone marrow mononuclear cells isolated from rats into rat models of injured spinal cord to explore the effect of bone marrow mononuclear cells for injured spinal cord functions, nerve regeneration, neovascuarization and long-term effect.
METHODS: Experiments were performed in the Experiment Center of Developmental Biology of Shanghai Second Medical University from October 2005 to April 2006. The laboratory is Specific-pathogen free grade. ①Female clean SD rats aged 8 weeks weighting 200-220 g were offered by Animal Experimental Centre of Chinese Academy of Sciences. Animal intervention met the animal ethical standard. ②Rat bone marrow mononuclear cells were isolated from the tibia and the femur by Ficoll-Paque density gradient centrifugation. Rat models of spinal injury were established. The 22 successfully established rat models were divided into 2 groups. Rat models in a model plus cell group (n =11) received the complete T9-10 transection of spinal cord, and then bone marrow mononuclear cells were transplanted into the vertebral canal. Rat models in a model plus DMEM group (n =11) received the complete T9-10 transection of spinal cord, and then DMEM was injected into adjacent region. Rat models in a sham operation group (n =9) received T9-10 spinous process and lamina of vertebra incision and then the incision was sutured. ③Hybridization in situ and immunohistochemistry technique were used to determine the survival of implanted cells in host spinal cord. BBB scale system was applied to assess the functional recovery of spinal cord nerves.
RESULTS: ①There was no significant difference in postoperative score at each time point in the sham operation group. The score was 0 point in the model plus DMEM group. The function of spinal cord did not recover. The function of spinal cord became better at weeks 2, 4, 6 and 8 in the model plus cell group. There were significant differences as compared with the model plus DMEM group and the sham operation group (P < 0.01). ②Hybridization in situ and immunohistochemistry technique showed that transplanted cells survived after the transplantation and expressed specific markers for neovascularization.
CONCLUSION: After 8-week transplantation, bone marrow mononuclear cells can survive, differentiate into neovascularization and improve function recovery of spinal cord.

Li CD, Yang JH, Liu Z, Li DP.Bone marrow mononuclear cell transplantation in the treatment of acute spinal cord injury.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(8):1431-1434(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1431(ps).pdf]

0 引言

脊髓中枢神经的各种损伤均会导致神经元的变性、坏死，使得损伤的神经元无法再生、修复而留下截瘫等严重后遗症，给社会和家庭带来了沉重的负担。近年来研究发现，各种干细胞移植可以提高脊髓的功能，在一定程度上能恢复脊髓中枢神经的功能。而骨髓单个核细胞移植治疗脊髓损伤，报道较少。本实验主要采用骨髓单个核细胞移植的方法，探讨其对急性脊髓损伤功能的恢治疗作用机制，为骨髓单个核细胞移植治疗脊髓损伤的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

设计：随机对照实验。
单位：上海第二医科大学发育生物学研究中心。
材料：实验于2005-10/2006-04在上海第二医科大学发育生物学研究中心实验室完成。8周龄SD雌性大鼠36只，体质量200~220 g，清洁级，由中国科学院实验动物中心提供(SCXK(沪)2003-0003)。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。
设计、实施、评估者：实验的设计者为第一作者，实施者为第三作者，评估由第二作者完成，均接受过培训。
方法：
脊髓损伤动物模型的制备与分组：将36只大鼠速眠新麻醉剂（0.5 mL/kg），腹腔注射麻醉，俯卧固定，取后正中切口长约1 cm 逐层切开, 分离肌肉, 暴露椎骨, 咬除T9~10棘突及相应椎板并打开椎管, 充分暴露脊髓背面及两侧, 用刮胡刀片将脊髓完全横断直到可触及后侧的椎体,确定脊髓完全横断，棉签轻压止血，逐层缝合至皮肤，制成脊髓损伤模型。死亡14只，其原因为麻醉意外，尿储留，出血过多等。将剩余22只随机分成2组：模型+细胞组：11只, 脊髓完全横断T9~10后，行椎管内注射细胞；模型+DMEM组：11只, 脊髓完全横断T9~10后在损伤邻近区注射DMEM；另取9只大鼠作为假手术组：9只, 仅剪除T9~10棘突和椎板后，不损伤脊髓，逐层缝合。
骨髓单个核细胞的分离、纯化：无菌条件下切取雄性SD大鼠股骨、胫骨，用2 mL无菌生理盐水冲洗骨髓腔,离心5 min、1 500 r/min弃去上清。依据文后文献[1]，通过用Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞。淋巴细胞分离液分离细胞悬液15 min、2 000 r/min，吸取白色界面层,再加2 mL无菌生理盐水离心漂洗5 min，1 500 r/min ,弃去上清液。光学显微镜下计数细胞，检测细胞活性为85%，再加DMEM培养液制成骨髓单个核细胞悬液，配制成所需浓度的单个核细胞悬液调整细胞浓度为6×1011 L-1，4 ℃保存，2 h内移植。
细胞移植术：脊髓损伤后，骨髓单个核细胞应用自制吹管连接无菌朔料纤维细管，分别向损伤脊髓处的近、远两端注射15微升骨髓单个核细胞悬液（细胞总数为6×1011 L-1）,约5 min内注完。对硬脊膜不做处理，仅缝合筋膜及椎旁肌，移植的细胞存在脊髓损伤远近端。假手术组和对照组大鼠注射同等量的细胞培养液（DMEM）。术后1周内每天给大鼠腹腔注射青霉素防止感染，挤压膀胱排尿至自身排尿反射恢复。
行为学评价方法：3组大鼠分别在处理后1~8 周进行BBB运动评分。BBB运动评分是将动物放入一固定场地。观察动物的臀、膝、踝关节、行走步态、躯干运动及其协调情况，根据BBB运动评分法标准[2]，由熟悉该评分标准的实验人员进行盲法评分。
组织学观察：取术后8周大鼠，速眠新麻醉剂腹腔注射麻醉(0.5 mL/kg)，并做4%多聚甲醛（PFA）固定液心脏灌注。取出脊髓，4%PFA固定，做冰冻切片，行原位杂交、免疫组织化学。即Y染色体检测，第1天：切片放入PBS中洗脱3次，每次5 min；乙醇梯度洗脱3次， 3 min/次；干燥后加探针和杂交液覆盖玻片85 ℃加热杂交5~7 min后至于冰上1 min；37 ℃烘箱过夜。第2天：分别在42 ℃2xSSC和0.1xSSC液中洗脱3次每次5 min；Buffer I洗脱5 min；37 ℃Buffer II洗脱30 min；加DIG抗体后37 ℃烘箱1 h；BufferI洗脱2次每次10min；Buffer II洗脱1次5 min；NBT/BCTP系统显色。
免疫组织化学：第1天：冰冻切片空气晾干；PBS洗脱3次，每次5 min；将切片放入3%H2O2/甲醇20 min；PBS洗脱3次，每次5 min；滴加3%BSA，30 min；滴加v-WF抗体（浓度=1∶100），4 ℃冰箱过夜。第2天 ：PBS洗脱3次，每次10 min；加二抗HRP，室温避光1 h；PBS洗脱3次，每次10 min；DAB试剂盒显色。
主要观察指标：骨髓单个核细胞移植后存活情况及损伤脊髓血管的分化。
统计学方法：由第一作者采用采用SAS 10.0软件进行统计学分析。数据以_x±s表示，组间样本比较采用方差分析，两两比较采用q检验，P < 0.01为差异有显著性意义，P > 0.05为差异无显著性意义。

2 结果

2.1 术后动物行为学观察 大鼠在术后12 h完全清醒，所有受试鼠均出现了极为典型的截瘫综合征；常伴有腹部胀气、尿潴留、排便困难伴硬结，排尿口处肿胀等，但观察8周后发现注射细胞的大鼠的后肢发软且无感觉障碍,相反没有注射细胞的大鼠后肢运动明显受限,僵硬且存在感觉障碍。各时间点行为学检测结果见表1。

假手术组在术后各时间点的观察中评分无明显差异，均属评分正常。而模型+DMEM组评分为0分，其脊髓功能无明显恢复。
模型+细胞组在2、4、6和8周，处于逐渐恢复的过程。与模型+DMEM组比较有统计学意义(P < 0.01)。
假手术组分别和模型+细胞组与模型+DMEM组比较差异非常显著 (P < 0.01)。
2.2 脊髓原位杂交和免疫组织化学结果 原位杂交(Y染色体检测)发现，在8周后模型+细胞组SD大鼠脊髓内可见细胞核呈黑紫色Y染色体的阳性细胞存活，见图1，2。
应用免疫组织化学+原位杂交方法，移植后8周可检测到移植的雄性SD大鼠骨髓单个核细胞嵌合入宿主脊髓的血管系统，见图3，4。

3 讨论

骨髓单个核细胞可能具有多种功能，它属于成体干细胞，既具有自我更新和分化潜能,又能释放某些细胞因子促进神经、血管再生[1]。其次它还可分泌多种促进血管生长因子[2]其中骨髓源性内皮祖细胞可参与生后血管再生过程，研究认为骨髓源性内皮祖细胞属于骨髓单个核细胞中的某些亚群[3]，Ott等[4]发现:CD34阳性的骨髓源性内皮祖细胞衍生细胞可在体外扩增培养，移植到体内时的心肌梗死模型,这些细胞可增殖、形成血管结构、并促进心肌梗死后左室功能的恢复，Chopp等[5]把骨髓单个核细胞移植损伤的大鼠脊髓，5周后BBB 评分显示实验组动物运动功能明显改善，免疫组化检查发现一些骨髓单个核细胞源性的细胞表达神经蛋白标志物。而内皮祖细胞的移植对局部组织的缺血，有明显的修复作用并且促进新生血管形成[6-7]。Asahara等[8]最先研究发现成年个体外周血中存在骨髓来源的血管内皮祖细胞。后来经过诱导分化为呈纺垂形的贴壁细胞，进而形成细胞网后者血管腔样结构，后被用来移植脊髓损伤有一定促进功能恢复的作用。另有研究表明，把骨髓单个核细胞通过心导管直接植入给慢性大鼠心肌缺血模型后，12周后通过免疫组化发现能够检测到血管的标志，及促进新生血管生成并提高心肌的功能[9]。有人从兔子自体提取的骨髓单个核细胞和纤维生长因子联合植入到兔的股骨缺损模型中时，结果证实2周后可以检测血管内皮细胞的CD31标志和骨的生成与对照组相比较显著的增加新生血管的形成和骨的再生[10]。Padilla等[11]研究提示骨髓单个核细胞有促进血管新生作用，对缺血的后肢有潜在的治疗作用。
在实验观察中，发现骨髓单个核细胞移植到脊髓损伤模型8周后，能在损伤区环境中存活，通过原位杂交、免疫组织化学检测等方法，在8周后能在损伤的脊髓区域检测到存活的骨髓单个核细胞；并且发现，在宿主体内存活并且表达血管细胞标志V-WF，促进了脊髓功能修复的作用。另外研究说明植入细胞能融入脊髓并长期存活体内促进神经功能恢复，而且完全适应机体内的微环境，并且能够分泌相关细胞因子[12-13]。其作用机制可能是骨髓单个核细胞含有的多系细胞可分泌多种细胞因子，如VEGF、bFGF、Ang-1，特异性作用于内皮细胞表面相应受体促进血管形成过程[14]，但近来，人们在成体外周血也发现内皮祖细胞，并证实外周血的内皮祖细胞是由骨髓动员而来[3]，提示内皮祖细胞参与的血管发生，另外做为混合细胞系的骨髓单个核细胞可能具有更好的细胞移植效果。研究表明将带有纤维基质的骨髓单个核细胞植入到大鼠的心肌的缺血模型中后，移植后8周检测发现与不带有纤维基质的对照组相比，所形成的新生血管较多并且能显著提高心肌功能。这可能与骨髓内含有血管分化多种因子动员血管内皮细胞向血管分化有关[15]。
骨髓单个核细胞包括成分较多，而其中的骨髓间充质干细胞则在骨髓细胞中含量最为丰富，在特定的条件下又可以分化为各胚层细胞,具有强大的扩增能力和多向分化潜能，是较理想的细胞来源[16]。以及内皮祖细胞能参与组成血管结构,以及骨髓细胞分泌的多种血管生长因子促进内皮细胞增殖等机制有关[17]，可能成为在缺血条件下促进血管再生的有效材料。新鲜抽取的骨髓单个核细胞不需体外扩增，更好地保留了骨髓间充质细胞和内皮祖细胞的分化潜能和自动迁移特性,并且避免了体外长期培养的污染机会。但关于骨髓单个核细胞促进血管再生的具体机制及植入细胞的最适时机、数量,促血管再生的远期效果以及在脊髓损伤中作用等尚需进一步研究明确。

4 参考文献

1 Vulliet PR , Greeley M, Halloran SM，et al.Intracoronary arterial injection of mesenchymal stromal cell and microinfarction in dogs. Lancet. 2004;363(9411):783-784
2 Tomita S , Mickle DA ,Weisd RD ,et al. Improved heart function with myogenesis and angiogenesis after autologous porcine bone marrow stromal cell transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg 2002；123(6):1132-1139
3 Shi Q,Rsfii S,Wu MH,et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood 1998；92（2）:362
4 Ott I, Keller U, Knoedler M, et al. Endothelial-like cells expanded from CD34+ blood cells improve left ventricular function after experimental myocardial infarction.FASEB J 2005;19(8):992-994
5 Chopp M, Zhang XH, Li Y, et al. Spinal cord injury in rat: treatment with bone marrow stromal cell transplantation.Neuroreport 2000；11( 13) : 3001- 3005
6 Kobayashi T, Hamano K, Li TS, et al. Enhancement of angiogenesis by the implantation of self bone marrow cells in a rat ischemic heart model. J Surg Res 2000;89 (2):189-195
7 Hamano K,Li TS ,Kobayashi T ,et al. Angiogenesis induced by the implantation of self bone marrow cells :A new material for therapeutic angiogenesis. Cell Transplant 2000;9(3):439-443
8 Asahara T,Murobara T, Sullivan A, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.Science 1997；275（5302）:964
9 Tse HF, Siu CW, Zhu SG，et al.Paracrine effects of direct intramyocardial implantation of bone marrow derived cells to enhance neovascularization in chronic ischaemic myocardium. Eur J Heart Fail 2007;9(8):747-753
10 Hisatome T, Yasunaga Y, Yanada S，et al.Neovascularization and bone regeneration by implantation of autologous bone marrow mononuclear cells. Biomaterials 2005; 26(22):4550-4556
11 Padilla L, Kr tzsch E, De La Garza AS, et al.Bone marrow mononuclear cells stimulate angiogenesis when transplanted into surgically induced fibrocollagenous tunnels: results from a canine ischemic hindlimb model. Microsurgery 2007;27(2):91-97
12 Liu WL，Yin BL，Yu FL，et al.Zhongguo Yishi Zazhi 2005；7（1）：72-74
刘文亮,尹邦良,喻风雷,等.骨髓单个核细胞缺血肢体局部移植对缺血组织血管再生作用的研究[J].中国医师杂志，2005,7(1)72-74
13 Iba O, Matasubara H, Nozawa Y, et al. Angiogenesis by implantation of peripheral blood mononuclear cells and platelets into ischemic limbs. Circulation 2002；106（15）:2019-2025
14 Kamihata H, Matsubara H, Nishiue T, et al. Implantation of bone marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional function viaside supply of angioblasts , angiogenic ligands , and cytokines Circulation 2001; 104(9):1046-1052
15 Ryu JH, Kim IK, Cho SW ，et al.Implantation of bone marrow mononuclear cells using injectable fibrin matrix enhances neovascularization in infarcted myocardium. Biomaterials 2005;26(3):319-326
16 Oswald J , Boxberger S, B rgensen J，et al.　Mesenchymal stem cell can be differentiated into endothelial cell in vitro.Stem Cell 2004; 22(3):377-384
17 Hamano K,Li TS,Kobayashi T,et al. The induction of angiogenesis by the implantation of autologous bone marrow cells: A noveland simple therapeutic method. Surgery 2001; 130(1):44-54