电针任脉和肌肉注射碱性成纤维细胞生长因子对脑缺血模型大鼠侧脑室下区原位神经干细胞增殖的影响***☆

刁利红1，于海波2，皮敏2，罗文舒2，饶晓丹2，刘远声2，杨卓欣2

课题背景：课题受国家自然科学基金、广州中医药大学博士后基金、深圳市南山区科技局基金3个基金资助。课题深入探讨电针任脉承浆、气海、关元等穴位对脑缺血后神经干细胞增殖与分化与碱性成纤维细胞生长因子作用的异同。

应用要点：应用免疫荧光双标、激光共聚焦显微镜检测等技术，观察针刺任脉经穴对线栓法造成中动脉缺血模型大鼠脑缺血后神经干细胞增殖与分化的影响，解析针刺治疗脑缺血的疗效及认识针刺任脉治疗脑缺血的机制。

术语解析：碱性成纤维细胞生长因子是哺乳动物和人体组织中存在的微量蛋白质，是一种多功能细胞生长因子，对于中胚层和神经外胚层源细胞具有显著的促增殖作用，能促进神经元的存活和突起生长,对神经胶质细胞有较强的促分裂作用,对多分化潜能的神经干细胞也有促增殖作用。

1深圳市南山区蛇口人民医院康复科，广东省深圳市 518067;　2广州中医药大学附属深圳医院，广东省深圳市 518033

刁利红☆，女，1969年生，四川省江津市人，博士，副教授，副主任医师，主要从事针灸的临床和实验研究。
dlh27@163.com

通讯作者：杨卓欣，广州中医药大学附属深圳医院，广东省深圳市518033

国家自然基金资助项目（30371808）*;广州中医药大学博士后资助项目（106B3YH04
11）*;深圳市南山区科技局2005资助项目*

摘要
目的:近来的研究认为，针刺任脉治疗脑卒中的机制在于针刺任脉可能产生与干细胞增殖分化有一些联系的生长因子。脑缺血损伤后调动内源性神经干细胞试图自我修复的途径应是多元化的,针刺及外源性生成因子的给予为其不同的途径。实验拟观察电针任脉和肌肉注射碱性成纤维细胞生长因子对脑缺血模型大鼠缺血侧脑室下区5-溴-2’-脱氧尿苷和5-溴-2’-脱氧尿苷/巢蛋白阳性细胞的表达的影响。
方法：实验于2004-09/2005-07在中山大学医学院解剖学实验室完成。①材料：选用成年健康雄性Wistar大鼠83只。将实验动物按随机抽签法分为5组：空白对照组6只、假手术组6只、模型组26只、电针任脉组23只、碱性成纤维细胞生长因子组22只。后3组又分为缺血后7，14和28 d 3个时间点进行观察。②干预：除空白对照组和假手术组外，其余大鼠采用线栓法制作局灶性脑缺血模型。再灌注后参考Longa神经病学评分标准，1~4分为造模成功。空白对照组不作任何处理；假手术组仅分离右侧颈总动脉并离断右颈外动脉，不予栓塞。电针任脉组大鼠于造模后第2天采用上海华谊医用仪器厂生产的G6805Ⅱ型电针仪针刺承浆、气海、关元3穴，针刺后加电，疏密波刺激（疏波30 Hz，密波100 Hz），强度6~15 V，以身体相应部位出现轻微颤动为准，持续时间为20 min。碱性成纤维细胞生长因子组：再灌后立即给药，肌注碱性成纤维细胞生长因子4 000 U/d，此后每天肌注碱性成纤维细胞生长因子，1次/d。模型组、假手术组大鼠于造模后第2天固定于针刺操作台上20 min，不予针刺。空白对照组大鼠不作任何处理。③观察指标：通过免疫荧光方法测定侧脑室下区5-溴-2’-脱氧尿苷和5-溴-2’-脱氧尿苷/巢蛋白阳性细胞的表达。用Olympus FV 500激光共聚焦显微镜系统，在200倍镜下，计数平均5个视野阳性细胞数。
结果：造模成功大鼠54只及空白对照组和模型组各6只进入结果分析。侧脑室5-溴-2’-脱氧尿苷阳性细胞数和5-溴-2’-脱氧尿苷/巢蛋白双标细胞：空白对照组与假手术组比较，差异无显著性意义（P > 0.05）。模型组与空白对照组相比，均有不同程度的增加，其中造模后7和14 d差异有显著性意义（P < 0.01）。电针任脉组和碱性成纤维细胞生长因子组造模后3个时间点与模型组比较，均有较大程度的增加，差异有显著性意义（P < 0.05~0.01）。碱性成纤维细胞生长因子组与电针任脉组相比,差异无显著性意义（P > 0.05）。
结论：电针任脉和肌肉注射碱性成纤维细胞生长因子均可促进局灶性缺血模型大鼠原位神经干细胞增殖，且两者作用相当。
关键词：神经干细胞；电针；任脉；碱性成纤维细胞生长因子；5-溴-2'-脱氧尿苷，5-溴-2'-脱氧尿苷/巢蛋白；脑缺血；增殖；大鼠

刁利红，于海波，皮敏，罗文舒，饶晓丹，刘远声，杨卓欣.电针任脉和肌肉注射碱性成纤维细胞生长因子对脑缺血模型大鼠侧脑室下区原位神经干细胞增殖的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(8):1435-1439
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1435(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)08-01435-05

Effects of electroacupuncture at the Ren channel and basic fibroblast growth factor injection on in situ neural stem cell proliperation in subventricular zone of cerebral ischemic rats

AIM:Recent studies have demonstrated that electroacupuncture at the Ren channel can treat stroke by the production of some neurodevelopment-related growth factors, which are associated with the proliferation and differentiation of stem cells. There are many approaches to regulate self-repair of endogenous neural stem cells after cerebral ischemic injury. Electroacupuncture and exogenous growth factors are two approaches of them. This study observed the effect of electroacupuncture at the Ren channel and intramuscular injection of basic fibroblast growth factor (bFGF) on the expressions of 5-bromodeoxyuridine (BrdU)-labeled and BrdU/Nestin-labeled positive cells in subventricular zone of cerebral ischemic rats.

METHODS: The experiment was performed at Laboratory of Anatomy, Medical College of Sun Yat-sen University from September 2004 to July 2005. ①Eighty-three adult healthy male Wistar rats were selected and randomly divided into blank control group (n=6), sham operation group (n=6), model group (n=26), electroacupuncture at Ren-channel group (n=23), and bFGF group (n=22). Three time points (7, 14 and 28 days after ischemia) were set in each of the latter three groups for observation. ②Except for blank group and sham operation group, the rats in the other groups were prepared into models of local cerebral ischemia by thread occlusion method. After reperfused, the rats were graded by neurological scoring and only rats ranged from 1 to 4 points were used for the experiment. Blank group was not given any treatment; in the sham-operation group, only rght common carotid artery was isolated and right external carotid artery was dissected without occlusion. On the second day after modeling, the rats in the electroacupuncture group were given acupuncture at the Chengjiang, Qihai and Guanyuan acupoints using G6805Ⅱelectroacupuncture apparatus (Huayi Medical Instrument, Shanghai) followed by sparse wave 30 Hz, dense wave 100 Hz, intensity 6 to 15 V till slight trill appeared in the corresponding position. The stimulation lasted for 20 minutes. In the bFGF group, the rats were immediately intramuscularly injected with 4 000 U/d bFGF after reperfusion, once a day. The rats in the model group and sham operation group were mounted on the acupuncture bench for 20 minutes on the second day after modeling with no acupuncture. ③The expressions of Brdu-labeled positive cells (cell proliferation) and Brdu/Nestin-labeled positive cells (neural stem cells proliferation) in the lateral subventricular zone were determined by immunofluorescence. Positive cells were counted in five visual fields using 200-fold Olympus FV 500 laser confocal microscope system.

RESULTS: Altogether 54 successfully modeled rats, 6 in blank group, and 6 in model group were included in the final analysis. There was no significant difference in BrdU and BrdU/Nestin-labeled positive cells between blank group and sham operation group (P > 0.05). BrdU and BrdU/Nestin-labeled positive cells were increased when the model group compared with normal group, and the differences were statistically significant on days 7 and 14 after modeling (P < 0.01). Compared with model group, BrdU and BrdU/Nestin-labeled positive cells were significantly increased on the 7th, 14th, and 28th days in electroacupuncture group and bFGF group (P < 0.05-0.01). But there was no significant difference between electroacupuncture group and bFGF group (P > 0.05).

CONCLUSION: The results demonstrate that both electroacupuncture at the Ren channel and injection of bFGF can equally promote multiplication of neural stem cells in rats with focal cerebral ischemia.

Diao LH, Yu HB, Pi M, Luo WS, Rao XD, Liu YS, Yang ZX.Effects of electroacupuncture at the Ren channel and basic fibroblast growth factor injection on in situ neural stem cell proliperation in subventricular zone of cerebral ischemic rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(8):1435-1439(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1435(ps).pdf]

脑缺血损伤可诱导内源性神经干细胞增殖[1]而对缺血损伤产生代偿性适应性反应。但也有人认为,脑缺血损伤可能刺激脑内成熟的间质细胞或星形胶质细胞返回到神经干细胞,再重新分化成受损最严重的神经元细胞,从而可能发挥修复和重排神经元网络的作用[2]。对处于最原始状态干细胞进行鉴定，多采用巢蛋白和5-溴-2'-脱氧尿苷等标记进行鉴定[3]。然而,不管何种形式，脑缺血损伤后调动内源性神经干细胞试图自我修复的途径应是多条的。所以神经干细胞的数量不足,而且调节迁移、分化、存活、神经元修复和突触形成的因子也不尽一致,因此,给予外源性生成因子及针刺增强内源性神经干细胞的活化均成为国内外科研工作者的目标[4-5]。本实验观察了针刺任脉经穴对脑缺血后原位神经干细胞增殖与分化的影响，同时深入探讨针刺任脉诱导神经干细胞增殖与碱性成纤维细胞生长因子作用的异同。

设计：完全随机分组设计，对照实验。
单位：深圳市南山区蛇口人民医院康复科,广州中医药大学附属深圳医院针灸科
材料：实验于2004-09/2005-07在中山大学医学院解剖学实验室完成。选用成年健康雄性Wistar大鼠83只（合格证号：粤检证书字2004A088），清洁级，体质量（250±10）g，由中山大学医学院实验动物中心提供，标准环境饲养。将实验动物随机分为空白对照组6只、假手术组6只、模型组26只、电针任脉组23只、碱性成纤维细胞生长因子组22只。
主要试剂:磷酸盐缓冲液（PBS）平衡液（博士德产品），牛血清白蛋白（BSA）（Sigma产品），Phosphoplus p44/42 MAP Kinase（Thr202/Tyr204）试剂盒（Cell Signaling产品）。其余试剂为国产分析纯。
主要仪器:JGD-RF射频双极电凝器（江苏张家港市航天医疗电器厂），大鼠脑立体定位仪（上海花木农机厂），BS 400S-WEI电子天平（Sartorius公司），微量加样枪（Gilson公司），Olympus FV 500激光共聚焦显微镜（Olympus公司）。
设计、实施、评估者：为全部作者，均受过专业培训，未采用盲法评估。
技术路线：
局灶性脑缺血大鼠模型的建立：取大鼠，用10%水合氯醛腹腔麻醉（350 mg/kg）仰卧手术台上，颈正中切开，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，电热烧灼器烧断颈外动脉的分支，结扎并游离颈外动脉主干一段，沿颈内动脉向下分离翼颚动脉，穿线沿起点结扎。将制备好的日本制尼龙线插入颈外动脉，经颈总动脉分叉处通过颈内动脉入颅至大脑前动脉(ACA)，尼龙线插入深度平均为（18.5±0.5）mm，以阻断该侧大脑中动脉的血流。缺血2 h后再灌注，再灌注时拉出尼龙线即可恢复大脑中动脉（MCA）血供[6-7]。再灌注后参考Longa等[8]神

经病学评分评定神经功能缺损，评定神经功能缺损程度的五级4分法标准：0分，无神经功能缺损症状；1分，轻微神经功能缺损，不能完全伸展左侧前爪；2分，中度局灶性神经功能缺损，向左侧转圈；3分，重度局灶性神经功能缺损，向左侧倾倒；4分，不能自发行走，意识水平下降。评分为1~4分则造模成功。正常组不作任何处理；假手术组仅分离右侧颈总动脉并离断右颈外动脉，不予栓塞。
干预:电针任脉组选择18只造模成功大鼠于造模后第2天予针刺，穴位定位参考《实验针灸学》[9]（人民卫生出版社，1997年第1版）中承浆、气海、关元三穴在大鼠取穴位标记的方法，针刺后加电，采用G6805型电针仪，疏密波刺激（疏波30 Hz，密波 100 Hz），强度6~15 V，以身体相应部位出现轻微颤动为准，持续时间为20 min。模型组（选择18只造模成功大鼠）、假手术组大鼠于术后第2天将其如任脉组大鼠般固定于针刺操作台上20 min，并不予针刺。空白对照组大鼠不作任何处理。碱性成纤维细胞生长因子组选择18只造模成功大鼠于造模后第2天肌肉注射碱性成纤维细胞生长因子4 000 U/d，再灌后立即给药，此后每次针刺后予肌注碱性成纤维细胞生长因子，1次/d。
取材：电针任脉组、碱性成纤维细胞生长因子组、模型组均于造模后7，14，28 d处死取材，空白对照组和假手术组于与前3组造模后7 d对应时间点取材。方法：用100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后，切开胸腹部，暴露胸腹腔脏器，将头端圆钝的针头由左心尖进入升主动脉并固定，以120 mL生理盐水快速灌注，同时剪开右心耳，当肝脏变为棕黄色、右心耳洗出液清亮时再用4%多聚甲醛 400 mL内固定，30 min内灌完，大鼠躯体变硬。将已灌注固定的大鼠固定在脑立体定位仪上，在Interaural 7.7 mm和Interaural 15.7 mm处进行脑冠状切并取脑，将上述端面间的脑组织块置于4 ℃ 40 g/L多聚甲醛中后固定6 h，再将组织块置于4 ℃ 300 g/L蔗糖溶液中，待脑组织块沉底后行冰冻切片，片厚30 μm。
5-溴-2’-脱氧尿苷免疫荧光测定：切片入 0.01 mol/L PBS洗3次，5 min/次→切片入3% H2O2，37 ℃，30 min，灭活内源性过氧化物酶→0.01 mol/L PBS洗4次，5 min/次→切片入50%甲酰胺/2×SSC， 65 ℃，2 h→2×SSC洗2次，5 min/次→2 mol/L HCl 37 ℃，1 h→1 mol/L硼酸缓冲液（pH 8.0）洗2次， 5 min/次→0.01 mol/L PBS洗2次，5 min/次→BSA 37 ℃，30 min，封闭非特异性抗原→小鼠5-溴-2’-脱氧尿苷单克隆抗体（BSA稀释至1∶1 000）37 ℃孵育2 h，4 ℃过夜→切片入0.01 mol/L PBS洗4次，5 min/次→羊抗小鼠IgG-Cy3荧光二抗（BSA稀释至1∶400）37 ℃孵育1 h→切片入0.01 mol/L PBS洗4次，5 min/次→裱片后37 ℃，1 h→甘油封片，进行荧光观察及拍照。
5-溴-2’-脱氧尿苷/巢蛋白免疫荧光双标测定：5- 溴-2’-脱氧尿苷免疫荧光测定同” 5-溴-2’-脱氧尿苷免疫荧光测定”→将切片入40 g/L多聚甲醛，室温1 h，使第一重染色中二抗的抗原结合部位失活→0.01 mol/LPBS洗 5次，5 min/次→小鼠巢蛋白单克隆抗体（BSA稀释至 1∶1 000）37 ℃孵育2 h，4 ℃过夜→0.01 mol/L PBS洗4次，5 min/次→羊抗小鼠IgG-FITC荧光二抗（BSA稀释至1∶400）37 ℃孵育1 h→0.01 mol/L PBS洗 4次，5 min/次→裱片后37 ℃，1 h→甘油封片，Olympus FV 500激光共聚焦显微镜进行荧光观察及拍照。用BSA代替一抗作为阴性对照。
结果观察：用Leica图像分析系统，在200倍显微镜下，观察各组切片的染色结果。每只大鼠每个指标选6张切片，每张切片取5个视野计数各组大鼠的阳性细胞数进行统计分析。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 13.0软件对计量资料进行单因素方差分析多样本均数间多重比较，对资料方差齐性进行Levene检验，按α=0.10水准，方差齐，则应LSD- t检验来判断差异的统计学意义，P < 0.05认为差异具有显著性；按α=0.10水准，若方差不齐，则应用Cochran & Cox近似t检验来判断差异的统计学意义，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析纳入Wistar大鼠83只，纳入造模成功大鼠54只及空白对照组和模型组各6只。
2.2 统计描述空白对照组、假手术组、模型组、电针任脉组、碱性成纤维细胞生长因子组大鼠缺血侧侧脑室5-溴-2’-脱氧尿苷和5-溴-2’-脱氧尿苷/巢蛋白双标染色结果分别见图1~5。
2.3 统计推断电针任脉和注射碱性成纤维细胞生长因子对缺血侧脑室5-溴-2’-脱氧尿苷和5-溴-2’-脱氧尿苷/巢蛋白阳性细胞影响的定量结果见表1。
空白对照组与假手术组侧脑室5-溴-2’-脱氧尿苷阳性细胞数和5-溴-2’-脱氧尿苷/巢蛋白双标细胞比较，差异无显著性意义（P > 0.05）；模型组与空白对照组相比，均有不同程度的增加，其中造模后7和14 d差异有显著性意义（P < 0.01）；电针任脉组和碱性成纤维细胞生长因子组造模后3个时间点与模型组比较，均有较大程度的增加，差异有显著性意义（P < 0.05~0.01）。碱性成纤维细胞生长因子组与电针任脉组相比,差异无显著性意义（P > 0.05）。

任脉不但主管胚胎妊娠，也与脑的生理病理密切相关，由此作者推测针刺任脉必然产生一些与发育相关的生长因子，这些发育相关生长因子与神经干细胞的增殖分化必然有一些联系。不仅可提高针刺治疗缺血性脑病的疗效，也可为深入认识任脉作用机制打下基础，具有临床和理论双重意义。就脑缺血损伤的修复而言，深入探讨电针任脉承浆、气海、关元等穴位对脑缺血后神经干细胞增殖与分化与碱性成纤维细胞生长因子的异同。
碱性成纤维细胞生长因子对于中胚层和神经外胚层源细胞具有显著的促增殖作用，同时，它也是内皮细胞的有丝分裂和血管再生因子，在神经系统的分化、发育和成熟过程中具有重要作用[10]。碱性成纤维细胞生长因子对中枢及外周多种神经元都有营养作用，不仅能促进神经元的存活和突起生长,同时对神经胶质细胞有较强的促分裂作用,对多分化潜能的神经干细胞也有促增殖作用[6-7]。
5-溴-2’-脱氧尿苷作为标记细胞增殖的药物，可以和S期细胞DNA结合[8-9,11-12]。而巢蛋白是神经干细胞所表达的一种特异性标志物[13-15]。脑缺血后大脑皮层和侧脑室附近的巢蛋白阳性细胞主要表现为星形胶质细胞形态，少量表现为神经元形态。提示脑缺血后反应性的星形胶质细胞表达巢蛋白，成为具有分化潜能的神经前体细胞。至于神经元样的巢蛋白阳性细胞，认为它们既可能是由多潜能的神经干细胞分化迁移而来，也可能是缺血引起的反应性神经前体细胞，由成熟神经元转变而来。还观察到有些增殖的细胞同时表达巢蛋白，证明缺血性损伤诱导了新细胞的发生[16-17]。
本实验显示电针任脉组组和碱性成纤维细胞生长因子组侧脑室5-溴-2’-脱氧尿苷、5-溴-2’-脱氧尿苷/巢蛋白阳性细胞均较模型组明显增多（P < 0.05~0.01），同时，碱性成纤维细胞生长因子组与相对应的电针任脉组相比，造模后7，14，28 d 5-溴-2’-脱氧尿苷、5-溴-2’-脱氧尿苷/巢蛋白阳性细胞均有不同程度的增加，但差异无显著性意义（P > 0.05）。提示电针任脉和注射碱性成纤维细胞生长因子均可促进脑缺血大鼠侧脑室神经干细胞的增殖。实验结果说明电针任脉经穴及注射碱性成纤维细胞生长因子对脑缺血大鼠神经干细胞均有促进增殖作用。

1 Korzhevskii DE, Lentsman MV, Gilyarov AV, et al.Induction of nestin synthesis in rat brain cells by ischemic damage. Neurosci Behav Physiol. 2008;38(2):139-143
2 Naruse M, Nakahira E, Miyata T, et al. Induction of oligodendrocyte progenitors in dorsal forebrain by intraventricular microinjection of FGF-2. Dev Biol. 2006;297(1):262-273
3 Chen Y, Sun FY. Age-related decrease of striatal neurogenesis is associated with apoptosis of neural precursors and newborn neurons in rat brain after ischemia. Brain Res. 2007;1166:9-19
4 Jungnickel J, Haase K, Konitzer J, et al.Faster nerve regeneration after sciatic nerve injury in mice over-expressing basic fibroblast growth factor.J Neurobiol 2006;66(9):940-948
5 Hagood SK, McGinn MJ, Sun D,et al.Characterizing the mitogenic effect of basic fibroblast growth factor in the adult rat striatum.J Neurotrauma 2006;23(2):205-215
6 Othman M, Lu C, Klueber K, et al. Clonal analysis of adult human olfactory neurosphere forming cells. Biotech Histochem. 2005;80(5-6):189-200
7 Zhang X, Cai J, Klueber KM, et al. Role of transcription factors in motoneuron differentiation of adult human olfactory neuroepithelial-derived progenitors. Stem Cells. 2006;24(2):434-42
8 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke 1989;20:84-91
9 Zhang B, Wang RZ, Lian ZG,et al.Experimental study on plasticity of proliferated neural stem cells in adult rats after cerebral infarction.Chin Med Sci J 2006;21(3):184-188
10 Guo H, Huang L, Cheng M, et al.Serial measurement of serum basic fibroblast growth factor in patients with acute cerebral infarction.Neurosci Lett 2006;393(1):56-59
11 Horky LL, Galimi F, Gage FH, et al.Fate of endogenous stem/progenitor cells following spinal cord injury.J Comp Neurol 2006;498(4):525-538
12 Roitberg BZ, Mangubat E, Chen EY, et al.Survival and early differentiation of human neural stem cells transplanted in a nonhuman primate model of stroke.J Neurosurg 2006;105(1):96-102
13 Gilyarov AV. Nestin in central nervous system cells. Neurosci Behav Physiol. 2008;38(2):165-169
14 Korzhevskii DE, Lentsman MV, Gilyarov AV, et al. Induction of nestin synthesis in rat brain cells by ischemic damage. Neurosci Behav Physiol. 2008;38(2):139-143
15 Encinas JM, Enikolopov G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 2008;85:243-272
16 Tonchev AB, Yamashima T, Sawamoto K, et al.Enhanced proliferation of progenitor cells in the subventricular zone and limited neuronal production in the striatum and neocortex of adult macaque monkeys after global cerebral ischemia.J Neurosci Res 2005;81(6):776-788
17 He Z, Cui L, Meschia JF, et al.Hippocampal progenitor cells express nestin following cerebral ischemia in rats.Neuroreport 2005;16(14):1541-1544