课题背景：湖南省自然科学基金资助项目（07JJ3044）。近年来研究显示，骨髓间充质干细胞具有独特的免疫调节特性，其治疗免疫相关性疾病与其免疫调节作用有关。心肌梗死后免疫炎症反应是推动心室重构的重要因素，主要表现为心肌局部炎性细胞因子异常表达、特异性心肌毒性淋巴细胞激活以及抗心肌细胞抗体生成等。课题前期实验发现心肌梗死后移植骨髓间充质干细胞可抑制心肌毒性淋巴细胞的激活，本实验在前期研究基础上进一步探讨骨髓间充质干细胞对心肌梗死炎性细胞因子表达的影响。

同行评价：：急性心肌梗死后，体内存在免疫炎症反应，是导致心室重构的重要机制之一。通过抑制其免疫炎症反应从而改善缺血心肌功能，是目前急性心肌梗死的治疗方向之一。关于干细胞移植对急性心肌梗死后炎症反应影响的报道，国内外鲜见，文章具有一定的新颖性，论据充足、数据准确、逻辑缜密，具有科学性和实用性，对其他研究具有借鉴作用。

应用要点：实验结果显示，骨髓间充质干细胞移植可调节大鼠梗死心肌促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的表达，上调抗炎细胞因子白细胞介素-10的表达，提示骨髓间充质干细胞可调节心肌梗死后所伴随的免疫炎症反应，通过调节心肌梗死后的促炎/抗炎因素的平衡来保护心肌细胞，抑制心室重构。

中南大学湘雅二医院心内科，湖南省长沙市 410011

杜优优☆，男，1980年生，河南省修武县人，汉族，中南大学湘雅医学院在读博士，主要从事骨髓干细胞移植研究。
du.youyou@yahoo.
com.cn

通讯作者：周胜华，教授，中南大学湘雅二医院心内科，湖南省长沙市 410011
zhougqin@21cn.
com

湖南省自然科学基金资助项目（07333704）*

摘要
目的:近来研究表明，骨髓间充质干细胞具有独特的免疫调节特性，实验拟观察骨髓间充质干细胞移植对梗死心脏炎性细胞因子表达的影响，以进一步认识干细胞治疗心肌梗死的可能机制。
方法：实验于2006-11/2007-08在中南大学湘雅二医院心内科实验室和实验动物中心完成。①实验材料：清洁级SD大鼠由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：提取体质量120~150 g SD大鼠骨髓间充质干细胞，以溴脱氧尿嘧啶核苷标记。取体质量180~200 g 雄性SD大鼠，结扎冠状动脉前降支建立心肌梗死模型，将模型随机分为3组：假手术组：仅穿线不接扎血管；PBS溶液注射组：模型制作成功即刻心外膜注射PBS液；干细胞移植组：模型制作成功即刻心外膜注射溴脱氧尿嘧啶核苷标记的骨髓间充质干细胞，每组8只。③实验评估：于术后1 ，28 d行心脏超声检测，测量大鼠射血分数、左室短轴缩短率和左室舒张末期直径以评价心脏功能，并进行免疫组织化学和western blot检测，分析移植细胞存活和炎性细胞因子的表达情况。
结果：24只建模成功大鼠均进入结果分析。①术后28 d，心脏超声检测显示与注射PBS溶液相比，移植骨髓间充质干细胞可以延缓心室重构，改善心功能[射血分数：（30.76±3.39）%，（24.06±4.71）%，P < 0.05；左室短轴缩短率：（29.33±4.87）%，（23.05±3.94）%，P < 0.05；左室舒张末期直径：（6.45±0.47）mm，（7.81±0.31）mm，P < 0.05] 。②免疫组织化学检测显示，心肌梗死后即刻心外膜移植的骨髓间充质干细胞可以在宿主体内存活。③ 与注射PBS溶液相比，骨髓间充质干细胞移植可以明显降低肿瘤坏死因子α、白细胞介素6表达（P < 0.05） ，同时增加白细胞介素10表达（P < 0.05) 。western blot检测与免疫组织化学结果一致。
结论：骨髓间充质干细胞移植可以延缓心肌梗死大鼠心室重构，同时下调大鼠梗死心脏促炎细胞因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达，上调抗炎细胞因子白细胞介素10表达。
关键词：骨髓间充质干细胞；免疫调节；心肌梗死；炎症反应

杜优优，周胜华，周滔，刘启明，苏华，潘宏伟，刘彬，黎荣山，杜万红.骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后炎性细胞因子表达的调节.[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(8):1440-1444
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1440(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)08-01440-05

收稿日期: 2007-11-20
修回日期：2007-12-20
(07-50-11-6427/GW·Q)

Effects of electroacupuncture at the Ren channel and basic fibroblast growth factor injection on in situ neural stem cell proliperation in subventricular zone of cerebral ischemic rats

Abstract

AIM:Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) process special immunological property. This study investigated the effect of BMSCs on myocardial inflammatory cytokines expression in rats after myocardial infarction to further analyze the mechanism of stem cells for myocardial infarction.
METHODS: Experiments were performed at the Cardiology Laboratory and Experimental Animal Center of Xiangya Second Hospital of Central South University from November 2006 to August 2007. ①Clean SD rats were provided by Experimental Animal Center of Xiangya Second Hospital of Central South University. Animal intervention met animal ethical standards. ②BMSCs were harvested from SD rats (120-150 g) and labeled with bromodexyuridine. Male rat (180-200 g) models of myocardial infarction were made by ligating anterior descending coronary. Rat models were randomly divided into three groups with 8 rats in each group. Rat models in a sham operation group only received threading. Rat models in a PBS injection group were treated with phosphate buffered solution (PBS) via epicardium injection after myocardial infarction models were succeeded. Rat models in a BMSC transplantation group were administrated with stem cells labeled with bromodexyuridine after myocardial infarction models were succeeded. ③Echocardiography examination was performed 1 day and 28 days after surgery to measure ejection fraction, left ventricular fractional shortening and left ventricular end-diastole diameter to assess cardiac function. Immunohistochemistry and Western blot were performed to investigate the injected cells and the expression of inflammatory cytokines.
RESULTS: Twenty-four SD rats were included in final analysis. ①Echocardiography showed that compared to injection of PBS, transplantation of BMSCs delayed ventricular remodeling and improved ventricular function 28 days after surgery [Ejection fraction: (30.76±3.39)%，（24.06±4.71）%，P < 0.05; Fractional shortening: （29.33±4.87）%，（23.05±3.94）%，P < 0.05; Left ventricular end-diastolic dimension (mm): （6.45±0.47）mm，（7.81±0.31）mm, P < 0.05]. ②Immunohistochemistry demonstrated that transplanted cells were found living in the hearts of the host. ③Compared to injection of PBS, BMSCs reduced the expression of tumor necrosis factor (TNF)-α and interleukin (IL)-6 (P < 0.05), and simultaneously increased the expression of IL-10 (P < 0.05). Western blot showed the same results as immunohistochemistry.
CONCLUSION: Transplantation of BMSCs down-regulated TNF-α and IL-6 expression and up-regulated IL-10 expression besides the prolongation of ventricular remodeling in myocardial infarction rats.

Du YY, Zhou SH, Zhou T, Liu QM, Su H, Pan HW, Liu B, Li RS, Du WH.Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation regulates inflammatory cytokines expression after myocardial infarction.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(8):1440-1444(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1440(ps).pdf]

0 引言

研究显示骨髓间充质干细胞移植可有效治疗心肌梗死[1-4]，但其确切的治疗机制并不清楚。免疫炎症反应是心肌梗死后推动心室重构发生与发展的重要因素之一，主要表现为炎性细胞因子异常高水平表达、抗心肌细胞抗体生成以及特异性心肌毒性T淋巴细胞激活等[5- 6]。体外研究与在体实验均表明骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）具有独特的免疫学特性，可抑制T细胞的活化，调节多种免疫细胞的功能[7-12]。研究显示MSC这一机制与调节相关炎性细胞因子的表达有关[11]。由此推测MSC移植对心肌梗死后免疫炎症反应可能具有一定程度的调节作用。基于此，本实验通过复制大鼠心肌梗死模型，观察MSC移植对心肌梗死后炎性细胞因子表达的影响。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
单位：中南大学湘雅二医院心内科。
材料：实验于2006-11/2007-08在中南大学湘雅二医院心内科实验室和实验动物中心完成。体质量120~150 g和180~200 g雄性清洁级SD大鼠由湘雅二医院实验动物中心提供，分别用于骨髓间充质干细胞提取和模型制作，并将制作模型随机分为3组：假手术组（n=8）、PBS溶液注射组（n=8）、干细胞移植组（n=8）。各组大鼠体质量差异无显著性意义。4只每笼饲养，饲养环境及饮食饮水无差异，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。
设计、实施、评估者：实验的设计、实施及评估为全体作者。
方法：
MSC分离培养、鉴定和体外标记：取体质量120~ 150 g雄性SD大鼠若干只，无菌条件下取出股骨和胫骨，用无血清的DMEM-LG培养液（GIBCO公司）冲出骨髓，制成细胞悬液，1 000 r/min离心15 min去除上清和脂肪，PBS缓冲液洗涤3次，用含体积分数为0.1胎牛血清（GIBCO公司）的DMEM-LG培养液调整细胞密度2×108 L-1,接种到培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为0.05 CO2的饱和湿度孵箱中培养。72 h首次换液去除未贴壁细胞，以后每3 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。细胞约80%融合时，采用25 g/L胰蛋白酶消化传代。取第3代细胞，25 g/L胰蛋白酶消化、PBS液洗涤后调节浓度为1.0×109 L-1,分别加入PE-CD29(MSC表面标志)、FITC-CD34（造血细胞表面标志）、FITC-CD45(白细胞共同抗原)抗体或FITC-IgG1（同种对照）（抗体均购自Biolegend公司），4 ℃孵育30 min，流式细胞仪检测细胞表面抗原。培养第3代细胞，接近65%左右融合时，换液后加入溴脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine, BrdU）（Sigma公司），调节BrdU终浓度至3 μmol/L，孵育24 h，弃去培养液，PBS液洗涤3次，25 g/L胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液（细胞密度为1×1010 L-1），移植备用。另取部分标记细胞制成细胞爬片，行BrdU细胞免疫化学检测，证实BrdU阳性标记率在75%以上。
模型制作和MSC移植：取体质量180~200 g雄性SD大鼠，按照文后参考文献[13]报道方法复制心肌梗死模型，结扎血管以下心室壁变白，心电图示ST段抬高为成功的心肌梗死模型。假手术组大鼠开胸后，仅穿线不结扎。模型制作成功后即刻，将细胞悬液（PBS液注射组注射PBS液）分4点自心外膜注射到梗死部位周边区域,每点0.1 mL，呼吸机鼓肺后逐层关胸。手术严格无菌操作，术后肌肉注射青霉素40万U/d，连续使用3 d，预防感染。随后，精心饲养。
大鼠心脏超声检测：各组大鼠分别于术后1 d和术后 28 d麻醉状态下，采用Sequoia 512型超声仪，探头频率 10 MHz行心脏超声检查，获取胸骨旁左室长轴和乳头肌水平短轴切面，测量左室舒张末直径、射血分数和短轴缩短率。
心脏标本的留取：超声检测完成后，麻醉大鼠，心腔内注射10% KCl溶液1mL，使心脏停于舒张期，迅速取出心脏，去除心脏表面脂肪组织及大血管，冰盐水冲洗干净。于左室长轴中点处垂直于长轴将心脏分为心尖半和心底半。
免疫组织化学检测：将待测心肌标本置40 g/L甲醛溶液中固定24 h，随后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。垂直心脏长轴连续切片，厚度3 μm,分别使用抗BrdU（Biosource公司）、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素10 抗体（Santa Cruz公司）行免疫组织化学染色，观察移植细胞存活及炎性细胞因子表达情况。
western blot检测：取梗死区周边心肌组织匀浆后提取总蛋白质，以牛血清白蛋白作标准曲线，BCA法测定蛋白浓度。常规电泳，转膜，封闭后分别加入抗大鼠肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素10 （Santa Cruz公司）和β-actin（abcam公司）一抗抗体，4 ℃轻摇过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记二抗（Santa Cruz公司），化学发光试剂增强反应，X线压片曝光，用GSD8000密度扫描分析系统（英国UVP公司）进行图像分析，分别以肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素10与β-actin条带的吸光面积积分比值来评定肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素10的蛋白表达水平。
主要观察指标：①大鼠心脏超声检查指标。②移植细胞存活情况。③大鼠心肌炎性因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素10免疫组织化学表达情况和western blot检测结果。
统计学方法：采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理。计量资料以_x±s表示。各组数据进行正态性和方差齐性检验。两组间均数比较采用独立样本 t 检验，以P < 0.05表示差异有显著性意义。统计学处理由中南大学湘雅二医院心内科实验室完成。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 24只建模大鼠均进入结果分析。
2.2 细胞形态观察和表面抗原检测情况 细胞培养 24 h后，更换培养液，可见少量MSC贴壁生长，呈长梭形；7 d时镜下可见克隆增殖；15 d左右细胞基本铺满培养瓶底，细胞间相互融合，呈相对均一的长梭形。消化传代，细胞可重新贴壁生长，并伸长变形为均一的长梭形。流式细胞检测显示培养第3代细胞表面抗原阳性表达率分别为：CD29(80.10%)、CD34（15.86%）、CD45(10.50%)，证实供体细胞为相对均一的MSC。
2.3 大鼠心脏超声检测情况 见图1。

大鼠心脏超声检测结果显示：术后1 d， PBS溶液注射组和干细胞移植组大鼠左室射血分数和短轴缩短率较假手术组明显降低，而左室舒张末直径明显增加；术后28 d， PBS液注射组大鼠左室射血分数和短轴缩短率进一步降低，左室舒张末直径进一步增大，见表1；MSC移植在一定程度上延缓了心功能的恶化。

2.4 BrdU免疫组织化学检测细胞存活情况 移植28 d后，胞核染色呈棕黄色的移植细胞可在受体心肌中存活，其周围未见明显炎症细胞浸润，见图2。

2.5 大鼠心肌梗死炎症因子免疫组织化学分析和western blot测定 心肌梗死后28 d，白细胞介素6、白细胞介素10和肿瘤坏死因子α在梗死周围存活心肌中表达增加，PBS液注射组大鼠各炎性细胞因子表达明显高于假手术组，而MSC移植可以降低白细胞介素6和肿瘤坏死因子α表达，并且增加白细胞介素10表达，见图3。western blot测定与免疫组化染色结果相一致，见图4。

3 讨论

动物实验和临床研究均证实MSC移植可有效治疗心肌梗死[1, 2, 14-15]。本实验结果显示：心肌梗死后移植MSC可以延缓心室重构，改善心功能； MSC移植可以明显降低大鼠梗死心脏肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达，同时增加白细胞介素10表达。
以往观点认为MSC治疗心肌梗死主要与其定向分化为心肌细胞有关[16]，然而这一观点目前受到了质疑：目前没有证据表明再生的心肌细胞参与原位心肌细胞的收缩；急性心肌梗死后移植的MSC仅有少部分细胞能够存活下来，即使移植的MSC定向分化为有收缩功能的心肌细胞，然而有限的新生细胞也很难在功能上起到治疗作用；部分研究发现移植的MSC并非发生了定向分化，而是与局部存活细胞发生了融合[17-18]；除心肌细胞分化外，部分研究证实MSC可通过旁分泌机制上调损伤局部多种生长因子，促进梗死部位血管再生，同时减少心肌细胞凋亡[3]。由此可见，MSC治疗心肌梗死的机制十分复杂，确切的治疗机制目前仍不清楚，除心肌细胞分化、血管再生以及抑制心肌细胞凋亡外，可能还有其他未知的机制。
近来研究发现MSC还具有独特的免疫抑制特性，可以抑制淋巴细胞增殖、抗原呈递细胞的活化与成熟，移植到受体后具有一定程度的免疫抑制和炎症调节作 用[7, 10-11, 19- 20]。Bartholomew等[21]研究发现，静脉注射狒狒骨髓来源的MSC可以延长同种异基因皮肤移植物的存活时间。有研究报道MSC可调节急性肾衰时肾脏的炎症反应[22]。
心肌梗死后同样伴随一定程度的免疫炎症反应，而且免疫炎症反应在心室重构进展中起着重要的推动作用，心肌梗死后调节免疫炎症反应可能成为抑制心室重构的新靶点。正常情况下，心肌组织很少表达肿瘤坏死因子α和白细胞介素6，而心肌缺血损伤可迅速激发上述细胞因子的高水平表达[23-24]。肿瘤坏死因子α和白细胞介素6作为促炎细胞因子对心肌细胞具有毒性作用，可以抑制心肌收缩功能，诱导心肌细胞凋亡，推动心室重构的进展[23, 25]。Sugano等[26]证实抑制肿瘤坏死因 子α活性可明显减小大鼠心肌梗死面积，改善心功能。因此，下调细胞因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达将有助于延缓心肌梗死后心室重构。为探讨MSC治疗心肌梗死的可能机制，本实验观察了MSC对心肌梗死后心肌细胞因子表达的影响，结果显示心肌梗死后28ｄ时肿瘤坏死因子α和白细胞介素6在梗死周围存活心肌内表达明显上调，MSC移植可明显减少肿瘤坏死因 子α和白细胞介素6的表达。此外，作为一种抗炎细胞因子，白细胞介素10 可由单核细胞、巨噬细胞、心肌细胞等多种细胞表达[13, 27-29]，可通过抑制核因子κB 活性而下调肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达，从而在一定程度上抑制炎症反应[30]。本实验结果显示心肌梗死后移植MSC可明显上调心肌白细胞介素10的表达。Beyth等[11]发现MSC存在时，混合淋巴细胞培养中的白细胞介素10水平增加，通过阻断白细胞介素10，MSC对细胞因子释放和T细胞增殖的抑制作用可被部分恢复。因此推测MSC下调心肌肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达可能与上调白细胞介素10表达有关。
MSC移植可调节抗炎细胞因子和促炎细胞因子的表达平衡，通过上调抗炎细胞因子和下调促炎细胞因子来调节心肌梗死后免疫炎症反应。因此作者推测MSC治疗心肌梗死可能部分归功于免疫炎症调节机制，MSC移植有望成为心肌梗死后免疫调节治疗的策略之一。

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