自体骨髓干细胞移植对心力衰竭患者近期心功能的影响**☆

游庆军1，沈振亚2，肖明第3，蒋锡初1

课题背景：课题为江苏省“135”重点人才培养项目（RC2003092）子课题及无锡市社会发展指令性项目(CS04--0001)。课题研究将自体骨髓干细胞应用于并发心力衰竭的扩张性心肌病、冠状动脉粥样硬化性心脏病和风湿性二尖瓣患者，取得了较满意的临床效果，拓展了骨髓干细胞移植的应用领域，为缺乏供体的扩张性心肌病患者提供了新的治疗手段，其临床应用范围的扩大带来了巨大的社会和经济效益。

应用要点：①在科研设计上，拓展了骨髓干细胞移植的应用领域，尤其将骨髓干细胞移植辅助应用于瓣膜疾病的外科治疗和扩张性心肌病等待心脏移植时的过渡治疗。②在心功能的评价手段上，将核素显像技术应用于干细胞移植前后的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者，结果更精确可靠。③在移植方式上，用于瓣膜疾病并发心力衰竭患者外科辅助治疗时，将骨髓干细胞悬液自左、右冠状动脉和心肌内注射，每个心肌注射点相距2 cm，注射点用生物蛋白胶封闭。

偏倚或不足：①入选病例较少，随访时间较短，远期效果有待于临床进一步验证。②对心功能的评价指标过于单一，有必要进一步丰富心功能评价指标，以更精确评价治疗效果。③下一步拟在并发心力衰竭的瓣膜病患者术前行干细胞移植，扩大此类患者的手术指征。

1 苏州大学附属第四医院胸心外科，江苏省无锡市 214062；2苏州大学附属第一医院心血管外科，江苏省苏州市 215012；3上海交通大学附属第一医院胸心外科，上海市 200038

游庆军☆，男，1975年生，江苏省泰州市人，汉族，2005年苏州大学医学院毕业，博士，副主任医师，主要从事冠心病的基础及临床方面的研究。
yooufriend@
yahoo.com.cn

江苏省“135”医学重点人才培养项目(RC2003092)*；暨无锡市科技局社会发展指令性项目（CS040001）*

摘要
目的:心肌细胞在人类出生后已几乎失去增殖能力，增加具有完整收缩功能的心肌细胞数目是治疗心力衰竭所致心肌损伤的关键。实验拟进一步观察和验证自体骨髓干细胞移植对心力衰竭患者近期心功能的影响。
方法：①对象：选取2003-10/2005-06苏州大学附属第四医院胸心外科收治的23例急性心肌梗死患者，随机数字表法分为心肌梗死细胞移植组7例，心肌梗死对照组16例。另选取2003-10/2005-06收治的11例严重风湿性心脏病、二尖瓣狭窄合并全心衰竭女性患者为二尖瓣病变细胞移植组，以2001-10/2003-10收治的同类疾病女性患者10例为二尖瓣病变瓣膜置换组。以上4组患者术前均依靠大剂量正性肌力药物和利尿剂维持心功能，患者及其家属对治疗均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法：无菌条件下在髂前上棘抽取骨髓25 mL，用DMEM完全培养基分离培养骨髓干细胞，贴壁筛选法进行纯化的。细胞达80%融合时用胰酶消化传代，取第3代细胞用于移植，浓度调整为1.5×1010 L-1。心肌梗死细胞移植组将自体骨髓干细胞悬液自左、右冠状动脉注入5 mL。心肌梗死对照组患者仅行常规治疗。二尖瓣病变细胞移植组患者在二尖瓣置换术中将自体骨髓干细胞悬液自左、右冠状动脉注入，同时行心肌内注射，每点注射0.1~0.2 mL，间距2 cm，注入量共5 mL。二尖瓣病变瓣膜置换组单纯行二尖瓣置换术。③实验评估：细胞移植前后通过心脏超声以及核素显像方法全面评价心功能。
结果：4组患者均完成3个月随访。①自体骨髓干细胞移植对急性心肌梗死心功能的影响：与心肌梗死对照组比较，术前 10 d及术后2周心肌梗死细胞移植组射血分数、心输出量、心肌梗死面积均基本相似（P > 0.05）；术后4，6，8周射血分数、心输出量均显著提高（P < 0.01），心肌梗死面积均显著缩小（P < 0.01）。②自体骨髓干细胞移植对风湿性二尖瓣病变心功能的影响：与二尖瓣病变瓣膜置换组比较，二尖瓣病变细胞移植组术后4周射血分数和心输出量均明显提高(t =3.97，P < 0.01；t = 3.61，P < 0.01) ，至术后8周差异最为明显，提高效果均显著优于术后4周（t =2.91，P < 0.05；t=2.64，P < 0.05）。
结论：自体骨髓干细胞移植可明显改善冠状动脉粥样硬化性心脏病心肌梗死患者的心功能，辅助用于风湿性二尖瓣并发心力衰竭患者的外科治疗亦能对心功能有所提高。
关键词：骨髓间充质干细胞；移植，自体；心力衰竭

游庆军，沈振亚，肖明第，蒋锡初.自体骨髓干细胞移植对心力衰竭患者近期心功能的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(8):1467-1471 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1467(ps).pdf]

Influence of autologous bone marrow stem cell transplantation on short-term heart function in cardiac failure patients

AIM:The myocardial cells lost their ability of proliferation when human being is born. Current researches have focused on how to treat heart failure by supplying functional myocardial cells. This study showed the effect of mesenchymal stem cell transplantation on late heart function in patients with heart failure.
METHODS: ①From October 2003 to June 2005, 23 patients with acute myocardial infarction were admitted at the Department of Cardiothoracic Surgery, Fourth Hospital, Soochow University into two groups randomly. 7 patients in experimental group were received bone marrow stem cell transplantation, while 16 patients in control group only cured with traditional way. At the same time, we took another 11 patients with severe rheumatic heart disease, severe bicuspid valve disease and heart failure into experimental group, and patients in experimental group were treated with bone marrow stem cell transplantation during the surgery of bicuspid valve replacement. Divided another 10 patients treated in the last 2 years with severe bicuspid valve disease and heart failure into control group, patients in control group were only performed bicuspid valve replacement. Above-mentioned patients received inotropic agent and diuretic agent to maintain heart function. Patients and their family members singed informed consents. The study was approved by Hospital Medical Ethics Committee. ② Bone marrow (25 mL) was aseptically collected from anterosuperior iliac spine. Bone marrow stem cells were generally taken from bone marrow，isolated and cultivated in DMEM medium. Cells of 80% confluence were passaged by trypsinization. Three passage of cells were used for transplantation at 1.5×1010 L-1. In experimental myocardial infarction group, we perfused 5 mL mesenchymal stem cells into the heart by coronary artery. Patients in the control myocardial infarction group only received routine therapy. While in experimental bicuspid valve disease group, 5 mL mesenchymal stem cells were perfused through coronary artery and injected into different parts of myocardium directly, 0.1-0.2 mL at each point, with an interval of 2 cm. Patients in the mitral lesion control group received replacement of mitral valve. ③Heart function was assessed by ultrasonic cardiography and radionuclide imaging.
RESULTS: All patients were followed up for 3 months. ①Compared to the control group, patients in experimental myocardial infarction group got significant improvement in cardiac output (CO), ejection fraction (EF) and myocardial infarct size 10 days before the surgery and 2 weeks after the surgery (P > 0.05). EF and CO were significantly elevated at week 4, 6 and 8 after the surgery (P < 0.01), and myocardial infarct size was shortened (P < 0.01). ②Compared to the control group, EF and CO were significantly elevated at week 4 after the surgery in the experimental bicuspid valve disease group (t =3.97，P < 0.01；t =3.61，P < 0.01), and significantly at week 8 （t =2.91，P < 0.05；t =2.64，P < 0.05）.
CONCLUSION: Autologous bone marrow stem cell transplantation can improve heart function of patients with coronary atherosclerotic heart disease heart failure, so does in patients with rheumatic mitral valve and cardiac failure.

You QJ, Shen ZY, Xiao MD, Jiang XC.Influence of autologous bone marrow stem cell transplantation on short-term heart function in cardiac failure patients.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(8):1467-1471(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1467(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)08-01467-05

增加具有完整收缩功能的心肌细胞数目，是治疗心肌损伤的关键。细胞移植是一个切实可行的增加成体心肌细胞的方法，由于自体骨髓间充质干细胞在体外有良好增殖能力，并能在心肌内环境下分化为损伤组织所需要的心肌细胞，而且无移植后的免疫排斥反应，因而在心肌损伤的治疗中倍受重视[1-3]。研究发现通过外源性细胞的植入，可重塑心肌结构，改善心肌的收缩功能和室壁的顺应性[4-5]；另外植入的细胞可以通过自分泌或旁分泌生长因子，促进血管新生，最终全面改善心脏功能[6-7]。本实验在大量动物实验的基础上对心力衰竭患者施行了骨髓干细胞移植术，患者术后心功能明显改善，预期效果满意。

设计：随机对照，病例分析。
单位：苏州大学附属第四医院胸心外科，上海交通大学附属第一医院胸心外科，苏州大学附属第一医院心血管外科。
对象：选取2003-10/2005-06苏州大学附属第四医院胸心外科收治的23例急性心肌梗死患者，剔除有左、右心室肥厚、束枝及室内传导阻滞、预激综合征以及极度顺钟向转位者。随机数字表法分为两组：心肌梗死细胞移植组7例，男5例，女2例；年龄53~72岁，平均60.5岁；前壁心肌梗死6例，下壁心肌梗死1例。心肌梗死对照组16例，男9例，女7例；年龄55~74岁，平均62.5岁；前壁心肌梗死13例，下壁心肌梗死3例。两组患者均在急性心肌梗死症状出现后24 h内入院，在年龄、梗死部位及溶栓治疗方面差异无显著性意义。
选取2003-10/2005-06收治的11例严重风湿性心脏病、二尖瓣狭窄合并全心衰竭女性患者为二尖瓣病变细胞移植组，年龄（49.0±7.3）岁，术前NYHA Ⅲ~Ⅳ级，射血分数(38.5±4.7)%，心输出量(4.0±0.9) L/min。另取2001-10/2003-10收治的同类疾病女性患者10例为二尖瓣病变瓣膜置换组，年龄（43±10.4）岁，术前NYHA Ⅲ~Ⅳ级，射血分数(43.3±3.4)%，心输出量(4.2±0.3) L/min。
以上4组患者术前均依靠大剂量正性肌力药物和利尿剂维持心功能，患者及其家属对治疗均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。
设计、实施、评估者：设计、干预实施、资料收集及结果评估皆由第一作者完成，经过正规培训，单盲法评估。
方法：
骨髓干细胞的分离及培养：严格无菌条件下在髂前上棘抽取骨髓25 mL，用DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，将冲洗液1 000r/min离心 5 min，弃上清，重新悬浮沉淀，2 000 r/min离心20 min，吸取交界面处悬浊液，用50 mL磷酸盐缓冲液重新悬浮，1 000 r/min离心 5 min，弃上清液，×2次。加入DMEM完全培

养基混悬细胞，移入培养瓶，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中进行培养，用贴壁筛选法纯化骨髓干细胞，每3 d换液1次。经数次换液后基本达到纯化目的。细胞达80%融合时，用质量浓度为2.5 g/L的胰酶进行消化传代。取传至第3代的骨髓干细胞，达70%融合时以2.5 g/L的胰酶消化，1 000 r/min离心5 min后，调整细胞浓度为1.5×1010 L-1。
自体骨髓干细胞移植：心肌梗死细胞移植组患者入院后给予常规治疗，第14天行股动脉穿刺，将备好的自体骨髓干细胞悬液自左、右冠状动脉注入5 mL。心肌梗死对照组患者仅行常规治疗。二尖瓣病变细胞移植组患者在二尖瓣置换术中将备好的自体骨髓干细胞悬液自左、右冠状动脉注入，同时行心肌内注射，每点注射0.1~0.2 mL，间距2 cm，注射点用生物蛋白胶封闭，注入量共5 mL。二尖瓣病变瓣膜置换组单纯行二尖瓣置换术。
心功能测定：心肌梗死细胞移植组、心肌梗死对照组分别于术前10 d及术后2，4，6，8周测定患者射血分数、心输出量水平。二尖瓣病变细胞移植组、二尖瓣病变瓣膜置换组分别于术前1周及术后4，8周测定患者射血分数、心输出量水平。在稳定状态下记录每例患者相关数据3次，取平均值。
心肌梗死面积检测：心肌梗死细胞移植组、心肌梗死对照组患者静注99mTc-MIBI25mCi，应用Sopha单电子发射型计算机断层显像仪行核素心肌灌注断层显像，以低于左心室最高计数的40%为域值，勾划不可逆放射性缺损区，应用极坐标靶心图法进行梗死心肌定量分析，心肌梗死面积=(心肌不可逆放射性缺损区面积/靶心图总面积)×100%。
主要观察指标：①自体骨髓干细胞移植对急性心肌梗死心功能的影响。②自体骨髓干细胞移植对风湿性二尖瓣病变心功能的影响。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0软件包进行统计处理，数据以_x±s表示，组间比较行样本均数t检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 参与者数量分析 4组患者均得到有效随访，随访3个月，全部健康存活并进入结果分析，中途无脱落。
2.2 自体骨髓干细胞移植对急性心肌梗死心功能的影响
2.2.1 心功能变化心肌梗死细胞移植组术后2周射血分数和心输出量较术前无明显变化（P > 0.05），术后4周射血分数和心输出量均明显提高（P < 0.01），至第6周提高效果尤为显著（P < 0.01），第8周与第6周基本相似（P > 0.05）。心肌梗死对照组常规治疗2周后射血分数和心输出量较术前有所提高（P < 0.05），第4，6，8周时改变不明显。
与心肌梗死对照组比较，术前10 d及术后2周心肌梗死细胞移植组射血分数、心输出量基本相似（P > 0.05），术后4，6，8周均显著提高（P < 0.01），见表1。

2.2.2 心肌梗死面积变化心肌梗死细胞移植组术后2周心肌梗死面积较术前无明显变化（P > 0.05），术后4周明显缩小（P < 0.05），至第6周降低幅度尤为显著 (P < 0.01)，第8周与第6周基本相似（P > 0.05）。心肌梗死对照组常规治疗2周后心肌梗死面积较术前有所下降（P < 0.05），第4，6，8周时改变不明显。
与心肌梗死对照组比较，术前10 d及术后2周心肌梗死细胞移植组心肌梗死面积无明显变化（P > 0.05），术后4，6，8周均显著缩小（P < 0.01），见表2。

核素心肌灌注放射性缺损断层显像结果见图1。
2.3 自体骨髓干细胞移植对风湿性二尖瓣病变心功能的影响与术前1周比较，二尖瓣病变细胞移植组术后4周射血分数和心输出量均明显提高（t =8.67，P < 0.01； t =7.59，P < 0.01）；至第8周差异最为明显，提高效果均显著优于术后4周（t =3.31，P < 0.01；t=2.33，P < 0.05）。

与二尖瓣病变瓣膜置换组比较，二尖瓣病变细胞移植组术后4周射血分数和心输出量均明显提高(t=3.97，P < 0.01；t=3.61，P < 0.01) ，至术后8周差异最为明显，提高效果均显著优于术后4周（t=2.91，P < 0.05；t=2.64，P < 0.05）。见表3。

2.4 不良事件和副反应 4组患者生活质量均明显改善，患者无明显心悸气急，无咳嗽，无紫绀，能参加正常工作学习，心功能恢复为Ⅰ~Ⅱ级(NYHA)。心肌梗死细胞移植组和二尖瓣病变细胞移植组患者术后无一例出现恶性心律失常。

风湿性二尖瓣疾病的晚期和冠状动脉粥样硬化性心脏病心肌梗死严重时都并发有全心衰竭，心肌细胞肥大、变性、纤维化及坏死，引起心肌细胞代谢异常及数量的减少，有效功能减退，终因慢性进展性充血性心力衰竭、心律不齐而死亡。对于无条件施行PTCA的患者，如何增加有功能的心肌细胞，尽快改善心功能，仍然是摆在人们面前的难题。手术换瓣是治疗风湿性二尖瓣疾病的有效方法，但有围术期高风险和术后心功能恢复缓慢之弊[8]。
骨髓干细胞易于获得和体外培养、扩增方便，移植于自体心脏可存活，无免疫排斥反应。目前较多应用于冠心病、心肌梗死等缺血性心脏病及慢性充血性心力衰竭的内科治疗，取得了较好的疗效，未发现有明显副作用[9-11]。而用于严重瓣膜疾病合并全心衰竭患者的外科辅助治疗未见相关报道。
前期实验中，本课题组在梅山猪的身上通过心室快速起搏建立心力衰竭模型，将Brdu标记的骨髓干细胞通过冠状动脉注入猪心肌内，结果表明猪的心功能得到明显改善，并证明了干细胞存活于猪心脏内膜，见图2。

在此基础上，本实验心肌梗死细胞移植组7例患者在急性心肌梗死2周后进行骨髓间充质干细胞移植，结果表明干细胞移植组患者自术后4周起心功能开始改善，到术后第6周效果最为明显，并维持到第8周。而心肌梗死对照组2周后好转，但到第4，6或8周时改变不明显。统计学表明心肌梗死细胞移植组效果显著优于心肌梗死对照组。核素心肌灌注断层显像表明干细胞移植组患者梗死区灌注加强，梗死面积缩小，这种变化在干细胞移植后2周开始，到第4周达高峰，第6，8周改变不明显。由此推测干细胞移植后2周转变为心肌细胞，并促进血管新生，从而使梗死区灌注加强，减小梗死面积，改善心功能。本实验患者无一例术后出现恶性心律失常。随访6~23个月均无心悸感觉,心电图及24 h动态心电图未发现严重心律失常及其他不良反应，充分证明了其应用的安全性。本实验结果与Mocini等[12]结果相似：自体骨髓干细胞移植并不增加心律失常的发生，相反随着心功能的改善，心律失常的发生有所减少。
本实验另对11例严重风湿性心脏病、二尖瓣狭窄并发全心衰竭患者在二尖瓣置换术中通过冠状动脉注入和直接心肌内多点注射干细胞，结果患者的心功能得到明显改善，术前术后心胸比明显缩小，且全组健康存活。与单纯行二尖瓣病变瓣膜置换组相比，二尖瓣病变细胞移植组干细胞移植后第4周开始射血分数和心输出量增加明显，心功能优于术前；而在第8周差异最为明显。由此作者认为移植到心肌内的干细胞在术后第4周左右开始参与心脏的舒缩功能，至第8周时这种作用得到充分发挥。两组患者无一例术后出现恶性心律失常也充分证明了其应用的安全性。
尽管骨髓干细胞心肌移植后能否转化为心肌细胞尚存争论，但动物和临床研究均证实骨髓干细胞移植能够改善心功能，其机制有以下几种可能：①弹性十足的移植细胞能给心室壁提供一个强有力的构架，从而限制纤维化及心腔的扩张。实验结果显示细胞移植后心脏舒张末期容量减少，这可证实移植细胞是通过限制心肌过度修复来发挥作用的[13-14]。②骨髓干细胞主要通过分化为生肌祖细胞来提高心肌收缩功能。亦有实验[15-17]表明骨髓干细胞能表达心脏特异性标记物(如肌钙蛋白1和connexin-43分子)，这与心脏功能的改善密切相关。③骨髓造血干细胞主要通过表达生长因子和促血管生长因子来发挥作用[18-19]。它可提高移植细胞的存活率，并诱导处于休眠状态的心肌细胞重新发挥收缩功能。本科室临床研究也证实了在心肌灌流显像改善的同时心功能得到不同程度的提高。目前关于骨髓干细胞移植数量、移植时间、移植途径和远期疗效均无定论，还有待于进一步研究。
对于各种原因所致的心力衰竭患者行自体干细胞移植，补充有功能的心肌细胞，能改善患者的心衰症状，促进康复。此技术的成功开展能扩大终末期心脏疾病的手术适应证，促进心力衰竭患者的术后恢复，也为对于无条件施行PTCA的心梗患者提供了新的有效治疗手段。本实验在动物实验的基础上，对并发心力衰竭的冠状动脉粥样硬化性心脏病心肌梗死和风湿性二尖瓣疾病患者实行了骨髓干细胞移植，初步结果显示患者近期心功能明显改善，对心力衰竭的临床治疗作了积极有益的探索，其远期疗效还有待进一步研究。

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