依那西普对钛颗粒诱导小鼠骨溶解及破骨细胞增殖的影响**★

张亮，陈志荣，吴兴临，金群华

课题背景：课题受国家自然科学基金项目（30560155）和教育部科学技术研究重点项目（206161）资助。课题组在前期实验中证实依那西普在体外可以抑制破骨细胞的增殖与活性，并且可以抑制磨屑诱导巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α。本实验进一步观察依那西普在体内对钛颗粒诱导小鼠骨溶解及破骨细胞增殖的影响，阐释依那西普抑制骨溶解的机制。

同行评价：选择肿瘤坏死因子α的拮抗剂依那西普为切入点，采用动物体内实验着重探讨关节置换后假体松动的早期防治，有一定的创新点，为临床解决关节置换后假体松动问题提供了一定的实验依据。

偏倚或不足：实验未在分子生物学等方面对依那西普防治骨溶解及破骨细胞增殖的原理进行进一步观察，在可能应用于临床之前，还需用大动物作进一步验证及长时间的观察。

宁夏医学院附属医院骨科三病区，宁夏回族自治区银川市 750004

张亮★，男，1975年生，浙江省萧山市人，满族，宁夏医学院在读硕士，主治医师，主要从事关节外科专业方面的研究。
zhang-liang-086@
163.com

通讯作者：金群华，教授，主任医师，博士，宁夏医学院附属医院骨科三病区，宁夏回族自治区银川市 750004 jinqunhua@sina.com

国家自然科学基金资助项目（30560155）*；教育部基金资助项目（206161）*

摘要
目的：已证实肿瘤坏死因子α在人工关节无菌性松动和类风湿关节炎的发病机制中均发挥重要的作用。依那西普作为肿瘤坏死因子α拮抗剂在治疗类风湿关节炎中疗效显著。拟通过实验观察依那西普对钛颗粒诱导小鼠骨溶解及破骨细胞增殖的影响，为依那西普防治人工关节无菌性松动提供实验依据。
方法：实验于2007-02/2007-08在宁夏医学院生殖及遗传学重点实验室和宁夏医学院附属医院病理学实验室完成。①60只BALB/C小鼠随机分为6组，每组10只。分别为空白对照组，单纯钛处理组，20，50，100，200 μg/kg依那西普+钛处理组。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。依那西普由美国Wyeth公司提供（生产批号：P321686）；钛金属颗粒由美国Zimmer公司提供。②建立钛颗粒骨吸收模型，其中空白对照组行原位缝合，不置入钛颗粒。依那西普各组分别在第0，2，4，6，8天腹腔注射不同剂量的依那西普(20，50，100，200 μg/kg)。10 d后取出颅骨，行常规苏木精-伊红染色，了解骨吸收情况。抗酒石酸酸性磷酸酶染色计算破骨细胞数量。
结果：苏木精-伊红染色结果为单纯钛处理组骨吸收明显增加，骨小梁结构紊乱及骨质疏松,破骨细胞的形态变大，数目变多；依那西普干预组上述表现减轻，尤以200 μg/kg剂量为明显。与空白对照组相比，单纯钛处理组可明显增加骨溶解（P < 0.001）及破骨细胞生成（P < 0.001）；与单纯钛处理组相比，依那西普各组可减少骨溶解（P < 0.05）及破骨细胞生成（P < 0.05），尤以200 μg/ kg剂量最为明显（P < 0.05），抗酒石酸酸性磷酸酶染色与苏木精-伊红染色结果相符。
结论：依那西普可抑制钛颗粒诱导的骨溶解及破骨细胞的增殖，有望成为预防人工关节无菌性松动的药物。
关键词：磨损颗粒；依那西普；破骨细胞；骨溶解; 人工关节

张亮，陈志荣，吴兴临，金群华.依那西普对钛颗粒诱导小鼠骨溶解及破骨细胞增殖的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(9):1601-1604 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-9/9k-1601(ps).pdf]

中图分类号: R318
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)09-01601-04

Effects of etanercept on Ti particle-induced osteolysis and osteoclastogenesis in mice

Abstract
AIM: It has been demonstrated that tumor necrosis factor-α (TNF-α) plays an important role in the pathogenesy of artificial joint aseptic loosening and rheumatoid arthritis. Etanercept, antagon of TNF-α, shows notable effect in treating rheumatoid arthritis. In this study, we investigated the influence of etanercept on Ti particles-induced osteolysis and osteoclastogenesis in mice and evaluate the feasibility of etanercept for treatment of artificial joint aseptic loosening.
METHODS: The experiment was performed at the Key Laboratory of Genesiology and Genetics, and Pathological Laboratory of Hospital, Ningxia Medical College from February to August 2007. ①Sixty BALB/C mice were randomly divided into 6 groups (n =10): blank control group, Ti (Zimmer, USA) treatment group, and 20, 50, 100, 200μg/kg etanercept (Wyeth, USA, No. P321686) plus Ti treatment group. ②Bone resorption models of Ti particles were established in all groups exception blank control group (in situ suture with no Ti particles). Different doses of etanercept (20, 50, 100, 200μg/kg) were intraperitoneally injected into etanercept groups on days 0, 2, 4, 6, and 8, respectively. Ten days later, mice cranial bones were harvested for HE staining to observe bone resorption. Number of osteoclast was counted using tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP).
RESULTS: HE staining showed that bone resorption in Ti treatment group was increased obviously and the structure of bone trabecula was disorderly and osteoporotic; the volume of osteoclast was enlarged and number was increased. The findings were reduced in etanercept groups, especially in 200μg/kg group. Compared with blank control group, Ti particles significantly increased osteolysis (P < 0.001) and osteoclastogenesis (P < 0.001); compared with Ti particles group, etanercept effectively inhibited Ti particles induced osteolysis (P < 0.05) and osteoclastogenesis (P < 0.05), especially in 200μg/kg group (P < 0.05). The result of TRAP was accorded with HE staining.
CONCLUSION: Etanercept can inhibit Ti particles-induced osteolysis and osteoclastogenesis in vivo and is promising to be a therapeutic candidate for the prevention of artificial joint aseptic loosening.

Zhang L, Chen ZR, Wu XL, Jin QH.Effects of etanercept on Ti particle-induced osteolysis and osteoclastogenesis in mice. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(9):1601-1604(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-9/9k-1601(ps).pdf]

人工关节置换是治疗终末期关节疾患的有效方法,晚期关节假体周围的骨溶解及松动是影响其疗效的主要因素，有报道表明置换后20年的松动率可达20%[1]。研究证实假体周围的磨损颗粒所引起机体的一系列生物学改变是晚期松动的主要原因，肿瘤坏死因子α是此反应链的上游关键因子。依那西普是肿瘤坏死因子α的拮抗剂，在类风湿性关节炎的治疗中疗效显著。因此本实验通过观察依那西普在关节磨损颗粒诱导体内骨溶解及破骨细胞增殖的作用，为依那西普防治人工关节无菌性松动提供一定的实验依据。

设计：随机对照动物实验。
单位：宁夏医学院附属医院骨科。
材料：实验于2007-02/2007-08在宁夏医学院生殖及遗传学重点实验室和宁夏医学院附属医院病理学实验室完成。
选用BALB/C小鼠60只，4~6周龄，清洁级，雌雄不限，平均体质量18 g ，由北京维通利华动物有限公司提供（质量合格证号（SCXK京2007-0001））。随机分为6组，每组10只。分别为空白对照组，单纯钛处理组，20，50，100，200 μg/kg依那西普+钛处理组。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。
主要试剂及材料：依那西普（Etanercept）由美国Wyeth公司提供（生产批号：P321686）；钛金属颗粒由美国Zimmer公司提供；抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒（TRAP、387-A）由美国Sigma公司提供；德国LeicaRM2135切片机。
设计、实施、评估者：实验设计为通讯作者，实验资料收集与实施为第一、二、三作者，评估为第四作者，采用盲法评估。
方法：
磨损颗粒的检测及制备：实验用磨损颗粒采用钛颗粒，形态不规则，平均直径2~5 μm。北京钢铁研究所复检结果示颗粒直径范围0.5~6.0 μm，99.99% < 5 μm。将颗粒悬于 180 ℃恒温箱6 h，70%乙醇浸泡48 h后除去乙醇。再将颗粒用无水乙醇浸泡过夜，沉淀48 h后去除无水乙醇，干燥后每30 mg分装，15 kPa高压蒸汽锅再次消毒30 min，37 ℃恒温箱烘干后备用。经此处理后根据商业检测试剂盒（厦门鲎试剂有限公司）检测，颗粒内毒素小于0.25 Eu/mL。
体内骨吸收模型的制作：本实验采用小鼠颅骨溶解模型[2]：将小鼠用6.5%水合氯醛按400 mg/kg剂量腹腔注射麻醉。无菌条件下取颅顶正中矢状切口，长约0.8 cm。分离皮下组织，显露出1 cm×1 cm颅骨区域。其中空白对照组行原位缝合。各钛处理组在颅顶放置30 mg钛粒后缝合皮肤。手术后等待小鼠清醒后放入笼中，置于清洁动物房中，动物自由摄取食物及水。依那西普组分别采用20，50，100，200 μg/kg依那西普腹腔注射干预。腹腔注射时间按第0，2，4，6，8天进行。第10天引颈处死小鼠，无菌条件下取出颅顶骨。此项操作中要求取出的颅顶骨以正中矢状线为中心的方形区域。取出标本用PBS液冲洗，10%中性甲醛固定，脱钙液脱钙3 d后石蜡包埋。
骨溶解的观察及计算：组织蜡块用德国LeicaRM2135切片机切片，连续三层切片，层厚3.5μm。行常规苏木精-伊红染色，了解骨吸收情况，同时也可了解破骨细胞的形态及数量。Olympus电子显微镜下在×40及×100观察，×40条件下摄像。图像用Matic images2.0软件处理，了解骨吸收情况并计算正中矢状线面积。
破骨细胞计数：抗酒石酸酸性磷酸酶染色是破骨细胞的特异性染色。组织蜡块连续3层切片，层厚3.5 μm。按说明书操作，将切片浸泡。避光37 ℃温箱温育90 min，着色完全后移去反应液。脱水干燥后明胶封固。Olympus电子显微镜×40及×100条件下观察，×100条件下摄像计算正中矢状线区域的抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性细胞数量。
主要观察指标：各组小鼠骨吸收溶解面积，破骨细胞数目。
统计学方法：结果用±s表示。所有数据由第一作者采用SPSS 11.0统计软件包处理。破骨细胞计数结果在ANOVA分析后进行配对ｔ检验（双侧），P < 0.05认为差异有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析 60只BABL/C小鼠均进入结果分析。所有标本均参与结果统计。
2.2 依那西普对钛颗粒诱导的骨溶解的影响苏木精-伊红染色提示在置入钛颗粒后, 在颅顶骨的骨吸收明显增加，骨小梁结构紊乱及骨

质疏松。破骨细胞的形态变大，数目变多。其中以单纯钛处理组最为明显。而经过依那西普干预各组上述表现减轻，尤以200 μg/kg依那西普组减轻最为明显。计算颅骨正矢状线骨破坏溶解面积，空白对照组为（0.075± 0.012）mm2、单纯钛处理组为（0.372±0.011）mm2、20 μg/kg依那西普组为（0.182±0.019）mm2、50 μg/kg依那西普组为（0.167±0.093）mm2、100 μg/kg依那西普组为（0.166±0.027）mm2、200 μg/kg依那西普组为(0.083±0.091) mm2。钛处理各组颅骨正矢状线骨破坏溶解面积均较空白对照组明显增加，差异有非常显著性意义(P < 0.001),。经过依那西普干预的各组骨破坏溶解面积较单纯钛处理组减少，差异有显著性意义(P < 0.05)。而依那西普各组间比较可知200 μg/kg依那西普组的骨破坏溶解面积最少，与其他3组相比，差异有显著性意义（P < 0.05），20，50，100 μg/kg依那西普组之间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。200 μg/kg依那西普组与单纯钛处理组之间差异有非常显著性意义（P < 0.001）。见图1。

2.3 依那西普对钛颗粒诱导的破骨细胞增殖的影响抗酒石酸酸性磷酸酶染色表明在置入钛颗粒后破骨细胞数目增加，经过依那西普干预后破骨细胞数目减少。其中空白对照组为（10.1±1.1）个、单纯钛处理组为 (32.3±4.2)个、20 μg/kg依那西普组为（23.4±1.7）个、50 μg/kg依那西普组为（21.5±6.5）个、100 μg/kg依那西普组为（22.7±3.4）个、200 μg/kg依那西普组为(12.3±2.8)个。钛处理各组中，破骨细胞数目均较空白对照组明显增加，差异有非常显著性意义(P < 0.001)。经过依那西普干预的各组中，破骨细胞数目较单纯钛处理组减少，差异有显著性意义(P < 0.05)。而依那西普干预的各组间比较可知200 μg/kg依那西普组的破骨细胞数目最少，与其他3组相比，差异有显著性意义（P < 0.05），20，50，100 μg/kg依那西普组之间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。200 μg/kg依那西普组与单纯钛处理组之间比较，差异有非常显著性意义。其结果也进一步印证了苏木精-伊红染色所见。见图2。

人工关节假体周围存在多种磨损颗粒，如钛颗粒、UHMWPE颗粒、骨水泥颗粒等。随着近几年金属-金属假体的流行应用，以钛颗粒为代表的金属颗粒是目前研究的热点。既往研究关节磨损颗粒对组织的反应多采用小鼠体内背部气囊模型。这个模型的优点是能够比较好的反映软组织对磨损颗粒的反应，可以容易的进行炎性细胞因子的分析。但这个模型对于反映骨溶解破坏不易做出定量测定，无法考虑骨自身的修复作用[3]。本实验采用小鼠颅骨溶解模型，此模型设计简单，结果可靠，近年来为较多学者应用来研究磨损颗粒诱导的骨溶解[4]。通过苏木精-伊红染色及抗酒石酸酸性磷酸酶染色分析颅骨正中矢状缝区域骨破坏溶解面积及该区域内抗酒石酸酸性磷酸酶阳性染色的破骨细胞数目变化，从而定量评价钛颗粒诱发的骨溶解，克服了小鼠体内背部气囊模型中不能定量反映骨溶解破坏的缺点。研究表明只有直径< 10 μm的金属颗粒才能被巨噬细胞吞噬并产生一系列的生物学效应，最终导致骨溶解及假体松动[5]。本实验选用的钛颗粒直径2~5 μm，符合生物学要求。实验表明在钛颗粒诱导的小鼠骨溶解吸收模型中，小鼠颅骨发生了明显的骨溶解吸收表现，这与人体内磨损颗粒诱导的骨溶解吸收表现相似。
正常骨重建中破骨细胞性骨吸收与成骨性骨形成的偶联是动态平衡的[6]。钛颗粒导致骨溶解和关节松动的主要机制是颗粒刺激了假体周围细胞产生生物学效应造成局部生化环境变化致骨代谢失衡。具体表现在钛颗粒引起巨噬细胞活化，释放前炎症因子，增强破骨细胞的活性，由活化的破骨细胞完成骨吸收[7]。此外，钛颗粒使局部组织的细胞浸润增强，浸润的单核细胞作为破骨细胞的前体，进一步分化为破骨细胞[8-10]，从而完成骨溶解吸收。
实验证实钛颗粒可以刺激巨噬细胞产生高水平的肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1等前炎症因子[11]。肿瘤坏死因子α刺激成骨细胞表达巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体激活剂的配体,从而促进破骨细胞的分化成熟并增强破骨细胞的功能[12-13]。肿瘤坏死因子α能促进已经与核因子κB受体激活剂的配体作用过的前体细胞分化为破骨细胞，也能激活成熟的破骨细胞，抑制破骨细胞的凋亡，增加成熟破骨细胞的成活率[14]。由此可见，肿瘤坏死因子α在整个生物学过程中扮演着重要角色[15]。
依那西普是一种重组的人可溶性肿瘤坏死因子受体蛋白，为二聚体融合蛋白，由人类Mr75 000肿瘤坏死因子受体的细胞外配体结合部分与人类IgGFc段连接而成，由934个氨基酸组成，相对分子质量为150 000[16]。在前期实验中发现依那西普可以明显抑制钛颗粒刺激巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子α，使其低水平表达[17]。本实验表明经过依那西普干预的各组中，破骨细胞数目较单纯钛处理组减少，尤其以200 μg/kg依那西普组明显。这就提示依那西普可以直接抑制破骨细胞的产生数量。实验计算小鼠正中矢状线面积来估算钛颗粒诱导的骨溶解严重程度并估算依那西普所产生的抑制作用。结果表明经过依那西普干预的各组中，骨吸收、骨小梁结构紊乱及骨质疏松表现减轻，尤以200 μg/kg依那西普组减轻最为明显。结合上述实验结果，可以认为依那西普可能通过以下途径完成其抑制骨溶解及破骨细胞增殖的作用：①抑制巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α，阻断肿瘤坏死因子α参与的诸多反应链。上游反应阻断后，骨溶解的生物学过程无法完整进行。②打断由肿瘤坏死因子α激活的破骨细胞前体细胞演变为破骨细胞的过程，使破骨细胞的数量减少，从而减少骨溶解及骨吸收。③直接抑制破骨细胞的骨吸收效能。
目前，选择性细胞因子阻滞剂一类的基因工程制剂是疾病预防治疗方面研究热点。而本实验中依那西普在抑制关节磨损颗粒诱导体内破骨细胞增殖及骨溶解的作用令人鼓舞，提示了用依那西普防治人工关节无菌性松动具有可行性，从而为早期防治人工关节松动提供了一个新的有效途径。

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